糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与caspase-3表达的关系

目的:观察糖尿病早期大鼠,视网膜神经细胞凋亡与caspase-3表达变化的关系。方法:健康雄性8周龄SD大鼠36只,建立糖尿病大鼠模型18只,正常对照18只。再各自分为4,8,12wk3组,每组6只大鼠。TdT介导DNA缺口末端的dUTP标记(TUNEL)法检测视网膜神经细胞的凋亡程度;免疫组织化学方法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测caspase-3mRNA表达情况。结果:正常对照组4,8,12wk大鼠均未见视网膜神经细胞凋亡。糖尿病组大鼠于建模后4wk即出现视网膜神经细胞凋亡,8wk和12wk大鼠视网膜神经凋亡程度较同期正常对照组大鼠均明显增强。神经细胞凋亡主要位于视网膜神经节细胞层及内核层。正常对照组4,8,12wk大鼠视网膜均未见caspase-3蛋白阳性表达,糖尿病组大鼠4wk即可见caspase-3蛋白阳性表达,8和12wk时表达增强。正常对照组4,8,12wk大鼠caspase-3mRNA表达RQ值分别为1.6±0.6,1.5±0.5,1.6±0.3;糖尿病组4,8,12wk大鼠caspase-3mRNA表达RQ值分别为5.7±1.2,12.6±2.3,14.3±2.1;较同期对照组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡可能与capase-3表达增强有关。     

内质网应激与糖尿病鼠视网膜神经节细胞凋亡的研究

目的 探讨葡萄糖调节蛋白(GRP78/Bip)半胱天冬酶12(Caspase-12)在糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中的表达及其与RGCs凋亡的关系.方法 STZ法建立24只DM模型鼠,按饲养时间1个月、3个月分为DM1个月组和DM 3个月组,12只正常SD大鼠为对照组.TUNNEL法检测视网膜细胞凋亡及存在的部位;免疫组织化学、Western blot及RT-PCR方法检测视网膜GRP78、caspase-12蛋白及Mrna的表达.结果 DM 1个月组出现RGCs凋亡,DM 3个月组凋亡增加.GRP78蛋白表达于正常组,DM 1个月、DM 3个月组表达较正常组增加(P＜0.01);caspase-12在正常视网膜中不表达,DM 3个月组表达与DM 1个月组差异有统计学意义(P＜0.01).GRP78、caspase-12mRNA均随着DM病程表达升高.结论 DM大鼠RGCs的凋亡随着DM病程延长而增加,RGCs的凋亡可能存在着内质网应激途径.     

菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡过程中线粒体途径的影响

背景研究表明线粒体途径在细胞的凋亡过程中发挥重要作用,而菩人丹（PRD）超微粉对视网膜神经细胞的凋亡可能有保护作用。目的探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜醛糖还原酶（AR）活性、神经细胞凋亡及线粒体凋亡途径的影响。方法采用随机数字表法将36只清洁级Wistar大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组及PRD治疗组,每组12只。糖尿病模型组、PRD治疗组大鼠均采用链脲佐菌素（STZ）25rag／（kg·d）连续腹腔注射3d,每日1次,建立2型糖尿病大鼠模型,以血糖≥16．7mmol／L为造模成功。模型成功建立后,PRD治疗组大鼠给予1．8g／（kg·d）PRD灌胃,每日1次,连续3个月。给药结束后取大鼠眼球,分离视网膜组织并制备匀浆和切片,采用紫外分光光度法检测视网膜组织中的AR活性;采用TUNEL法检测大鼠视网膜神经细胞的凋亡并计算凋亡指数（AI）;用Western blot法检测视网膜组织中B细胞淋巴瘤／白血病-2（bcl-2）、bcl-2相关x蛋白（bax）、细胞色素c（cyt—c）及半胱天冬酶-3（caspase-3）蛋白的表达。结果正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组大鼠视网膜组织中AR活性和AI的总体比较差异均有统计学意义（F=90．115、165．540,P〈0．01）,其中糖尿病模型组大鼠视网膜组织中的AR活性和神经细胞AI均明显高于正常对照组和PRD治疗组,差异均有统计学意义（P〈0．01）,TUNEL染色示阳性细胞主要位于视网膜神经节细胞（RGC）层和内核层。正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组大鼠视网膜组织中bax、cyt—c、caspase-3、bcl-2蛋白表达及bcl-2／bax值的表达明显不同,差异均有统计学意义（F=51．332、41．262、25．888、38．564、47．870,P〈0．01）,其中糖尿病模型组明显高于正常对照组和PRD治疗组,但bcl-2蛋白表达、bcl-2／bax比值则明显低于正常对照组和PRD治疗组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。大鼠视网膜AR活性、神经细胞AI、bax、cyt—c及easpase-3蛋白表达PRD治疗组与糖尿病模型组比较均明显降低,bcl-2蛋白表达、bcl一2／bax值则显著升高,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论PRD可通过抑制AR活性、上调凋亡抑制基因6cl-2的表达及下调凋亡促进基因bax、cyt—c和caspase-3的表达,抑制线粒体凋亡途径活化,减少糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡,发挥对糖尿病视网膜损伤的保护作用。     

糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与锰超氧化物歧化酶活性及mRNA表达变化的关系

目的 探讨糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与锰超氧化物歧化酶(MnSOD)活性及mRNA表达变化的关系.方法 对照实验研究.健康雄性8周龄SD大鼠72只,分为正常对照组及糖尿病组.糖尿病组大鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg体重,以诱导糖尿病大鼠模型;建模成功后再于建模后4、8、12周3个时间点分为3组,每组各12只大鼠.正常对照组不进行干预,与糖尿病组大鼠同时饲养,也按相同时间点分为4、8、12周3组,每组各12只大鼠.采用TdT介导DNA缺口末端的dUTP标记(TUNEL)法检测视网膜神经细胞凋亡指数,免疫组织化学方法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达水平,黄嘌呤氧化酶法检测MnSOD及铜一锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测MnSOD mRNA、Cu-ZnSODmRNA及easpase-3 mRNA表达情况.正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜神经细胞凋亡指数、视网膜caspase-3 mRNA表达水平、Cu-ZnSOD和MnSOD活性及mRNA表达水平比较,均采用两因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验法.结果 (1)正常对照组4、8、12周大鼠视网膜均未见神经细胞凋亡.糖尿病组大鼠于建模后4周即出现神经细胞凋亡,凋亡指数为(0.5±1.5)%;8和12周大鼠神经细胞凋亡指数为(5.7±3.9)%和(11.8±5.1)%.糖尿病组与正常对照组大鼠各时间点视网膜神经细胞凋亡指数差异有统计学意义(F=19.5412,P＜0.05).进一步两两比较,8和12周糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡指数较同期正常对照组大鼠均明显升高(均P=0.000).(2)正常对照组4、8、12周大鼠视网膜均未见caspase-3蛋白阳性表达,糖尿病组大鼠4周即可见caspase-3蛋白阳性表达,8和12周时表达增强.正常对照组4、8、12周大鼠caspase-3 mRNA表达RQ值分别为1.649±0.586、1.526±0.486及1.614±0.296;糖尿病组4、8、12周大鼠caspase-3 mRNA表达RQ值分别为5.672±1.193、12.566±2.272及14.297±2.11;正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜caspase-3 mRNA表达RQ值差异有统计学意义(F=105.175,P＜0.05).进一步两两比较,糖尿病组大鼠各时间点视网膜caspase-3 mRNA表达RQ值均较同期正常对照组明显升高(均P=0.000).(3)正常对照组4、8、12周大鼠MnSOD活性分别为(47.118±5.018)、(46.033±6.835)及(45.813±6.859)U/mg,MnSOD mRNA表达RQ值分别为0.973±0.123、0.974±0.085及0.994±0.074,CuZnSOD活性分别为(113.884±9.07)、(112.301±5.24)及(117.52±7.982)U/mg,Cu-ZnSOD mRNA表达RQ值分别为1.067±0.109、1.055±0.119及1.092±0.180.糖尿病组4、8、12周大鼠MnSOD活性分别为(33.863±6.909)、(22.877±7.875)及(20.034±6.796)U/mg,MnSOD mRNA表达RQ值分别为0.627±0.083、0.333±0.080及0.256±0.057;8和12周大鼠Cu-ZnSOD活性分别为(98.588±9.212)和(78.168±12.180)U/mg,Cu-ZnSOD mRNA表达RQ值为0.829±0.048和0.621±0.033.正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜MnSOD、Cu-ZnSOD活性及mRNA表达RQ值差异有统计学意义(MnSOD:活性F=19.709,P＜0.05;mRNA F=93.352,P＜0.05;Cu-ZnSOD:活性F=16.708,P＜0.05;mRNA F=16.332,P＜0.05).进一步两两比较,糖尿病组大鼠各时间点视网膜MnSOD、Cu-ZnSOD活性及mRNA表达RQ值均较同期对照组明显下降(MnSOD活性:4周P=0.002,8和12周均P=0.000;MnSOD mRNA:4、8、12周均P=0.000;Cu-ZnSOD活性:8周P=0.011,12周P=0.000;Cu-ZnSOD mRNA:8周P=0.001,12周P=0.000).结论 糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡可能与MnSOD活性及MnSOD mRNA表达水平下降有关.     

葡萄糖调节蛋白在急性高眼压大鼠视网膜中的表达及其意义

背景 青光眼导致的视网膜神经节细胞(RGCs)进行性死亡是导致患者视功能损害的主要病理基础,研究表明内质网应激(ERS)参与此过程,葡萄糖调节蛋白78( GRP78)是内质网中的特异性标志物,检测GRP78在高眼压诱导视网膜中的表达对青光眼患者视神经功能保护机制的研究具有重要意义. 目的 检测GRP78在大鼠急性高眼压后不同时期视网膜中的表达情况,探讨ERS在急性青光眼损伤中的作用.方法 56只Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、前房穿刺组、急性高眼压12h组及急性高眼压1、3、7、14 d组,每组8只眼.急性高眼压模型的制作采用前房穿刺灌注生理盐水法,眼压提高至66 mmHg.分别于造模后12h及1、3、7、14 d用过量麻醉法处死大鼠.苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜的病理形态学改变;免疫组织化学法检测视网膜中的GRP78蛋白表达的变化;实时定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测视网膜中GRP78 mRNA的表达变化. 结果 正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,急性高眼压后12h视网膜水肿增厚、细胞核肿胀,1d时视网膜形态学异常改变达到高峰,3d后水肿减轻,视网膜变薄.免疫组织化学染色显示正常对照组、前房穿刺组大鼠RGCs层和内核层GRP78蛋白呈弱阳性表达,A值分别为0.195±0.006、0.196±0.005,急性高眼压12h组大鼠GRP78在视网膜的表达明显增强,A值为0.293±0.011,造模后1d时GRP78表达强度达到高峰,A值为0.499±0.039,造模后3d时GRP78表达明显降低,A值为0.268±0.017,与正常对照组大鼠比较差异均有统计学意义(t=0.098、0.304、0.073,P＜0.05),但造模后7d和14 d时GRP78在大鼠视网膜RGCs层和内核层中的表达量接近正常,与正常对照组比较差异均无统计学意义( t=0.002、0.001,P＞0.05).实时定量RT-PCR检测表明,GRP78 mRNA在正常对照组大鼠视网膜的相对表达量( 2-△△CT)为1.011±0.013,眼压升高12 h快速上调,为1.536±0.145,1 d时达高峰,为2.141±0.171,3d时迅速降低,为1.420±0.212,与正常对照组比较差异均有统计学意义(t=0.525、1.130、0.409,P＜0.05),而造模后7d及14 d GRP78 mRNA在大鼠视网膜的表达量明显下降,与正常对照组比较差异均无统计学意义(t=0.020.0.004,P＞0.05).结论 GRP78参与大鼠急性高眼压后视网膜损伤的发生机制,提示通过对ERS过程进行干预可能达到保护急性高眼压眼视神经功能的目的.     

褪黑素对糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞凋亡的影响

目的研究褪黑素对糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞凋亡的影响。方法将54只健康雄性8周龄SD大鼠,随机分为正常对照组、糖尿病组及褪黑素组各18只,各组再按4周、8周、12周3个时间点随机分为3小组,每组各6只大鼠。正常对照组不进行干预;糖尿病组大鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素60mg·kg-1,以诱导糖尿病大鼠模型;褪黑素组在成功建立糖尿病大鼠模型后给予褪黑素(10mg·kg-1·d-1)灌胃进行干预。每只大鼠取左眼眼球,制作石蜡组织病理学切片,应用TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡情况。结果正常对照组4周、8周、12周均未见视网膜神经细胞凋亡。糖尿病组4周可见视网膜神经细胞凋亡,糖尿病组8周和12周视网膜神经节细胞凋亡指数较同期正常对照组大鼠均明显升高,糖尿病组4周、8周、12周凋亡指数分别为(0.48±0.53)%、(5.66±2.10)%和(11.83±1.58)%,8周及12周与同期正常对照组相比差异有统计学意义(均为P=0.000)。褪黑素4周组与同期糖尿病组神经细胞凋亡情况无明显差异,褪黑素组8周及12周较同期糖尿病组神经细胞凋亡情况有不同程度的减轻,视网膜神经节细胞凋亡指数有所下降,褪黑素组4周、8周、12周凋亡指数分别为(0.30±0.74)%、(1.67±0.54)%和(7.73±0.95)%,褪黑素组8周及12周时与同期糖尿病组相比差异有统计学意义(均为P=0.000)。结论褪黑素能够通过减轻糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞的凋亡,达到神经保护的目的。     

丝胶对糖尿病大鼠视网膜微血管的保护作用及其作用机制

背景 糖尿病视网膜病变(DR)是一种慢性炎症性疾病,并伴有微血管病变.研究证实丝胶具有抗炎和抗氧化功能,但其是否对DR早期的微血管结构和功能有保护作用目前仍不十分清楚. 目的 观察丝胶对糖尿病大鼠视网膜中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、Cx43表达的影响,探讨其对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的防护作用.方法 将48只SPF级健康雄性SD大鼠按计算机数字随机分配法分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组,每组12只.糖尿病模型组、丝胶治疗组、羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠均采用链脲佐菌素(STZ)连续腹腔内注射3d并给予高脂饲料饮食法制备糖尿病大鼠模型,成模后分别用生理盐水、2.4 g/(kg·d)丝胶溶液和0.2 g/(kg·d)羟苯磺酸钙灌胃3个月.采用过量麻醉法处死大鼠并制备视网膜标本,采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜组织的形态学变化.分别采用Western blot法和逆转录PCR技术检测大鼠视网膜中ICAM-1、VCAM-1和Cx43蛋白及其mRNA的相对表达量,并对各组检测结果进行比较. 结果 正常对照组大鼠视网膜组织结构正常,糖尿病模型组视网膜可见内界膜肿胀或断裂,偶见突出于内界膜的毛细血管内皮细胞,视网膜神经节细胞(RGCs)数量减少,丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠视网膜内界膜轻度增厚,内外核层细胞排列稍欠规则.糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙组阳性对照大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量较正常对照组大鼠均明显升高,而Cx43相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与糖尿病模型组比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量均明显降低(0.8343±0.032 l与0.918 9±0.042 4、0.7264±0.011 2与1.235 0±0.078 9),而Cx43相对表达量明显升高(0.133 1±0.015 3与0.039 2±0.002 0),差异均有统计学意义(均P＜0.05).与正常对照组比较,糖尿病组大鼠视网膜中ICAM-1mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显升高,而Cx43 mRNA表达明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与糖尿病模型组大鼠比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显下降(0.716 3±0.008 6与0.956 8±0.012 5;0.393 7±0.035 0与0.477 9±0.020 6),而Cx43 mRNA表达明显升高(0.676 8±0.064 8与0.4308±0.1113),差异均有统计学意义(均P＜0.05),各组ICAM-1 mRNA、VCAM-1mRNA和Cx43 mRNA相对表达量的变化趋势与其蛋白表达相同. 结论 丝胶能够减轻糖尿病大鼠早期视网膜的微血管病变,从而对DR的发生和发展发挥防护作用,其机制可能是下调视网膜中ICAM-1和VCAM-1的表达以及上调Cx43的表达.     

半胱氨酸蛋白酶3、bax和bcl-xl在N-甲基-N亚硝酸脲诱导的大鼠视网膜损伤后的表达

目的 观察N-甲基-N亚硝酸脲（MNU）诱导的大鼠视网膜损伤过程中凋亡相关分子半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相关X蛋白（bax）和B细胞淋巴瘤/白血病-xl（bcl-xl）在视网膜中的时空表达,探讨其在MNU诱导的视网膜损伤中的作用。方法 将鼠龄50 d的30只SPF级雌性SD大鼠随机分为MNU模型组（24只大鼠）和正常对照组（6只大鼠）。模型组按40 mg/kg的剂量腹腔注射MNU建立MNU模型;正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水5ml/kg。模型组大鼠根据MNU注射后不同处死时间再分为1、3、7、10 d组,每小组各6只大鼠。正常对照组大鼠注射后3 d处死。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组视网膜中caspase-3、bax和bcl-xl的基因表达情况;免疫荧光技术检测其在视网膜中的表达以及分布的变化,并用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导dUTP 缺口末段标记（TUNEL）法检测视网膜细胞凋亡的变化。结果经病理学检测确定造模成功。RT-PCR检测结果表明,［与正常对照组相比（caspase-3和bax的相对吸光度（RA）值为62.45±7.65、46.53±4.41］,MNU模型1 d 组caspase-3（83.23±8.11,P=0.009）和bax（72.73±9.46,P=0.004）的表达均增强,3 d 组二者表达水平均最高 （caspase-3 RA =140.48±18.40,P=0.000;bax- RA=102.36±13.97,P=0.001）,10 d 组caspase-3的表达水平（RA =47.32±5.37,P=0.027）低于对照组,而10 d bax的表达 （RA=48.27±4.40,P=0.997）基本恢复至对照组水平;bcl-xl在4个造模组中的表达水平（1 d RA =63.29±4.29,P=0.000;3d RA =79.83±5.58,P=0.000;7 d RA=70.19±4.42,P=0.000;10 d RA =66.05±4.97,P=0.000）均高于正常对照组（RA =45.98±3.06）,3 d 组的表达水平最高。MNU诱导后1、3、7 d 组的bax/bcl-xl比值（1 d为1.15±0.14,P=0.143;3 d为1.28±0.16,P=0.001;7 d为1.17±0.08,P=0.079）大于对照组（1.01±0.09）,其中3 d组的比值最大,但10 d 组bax / bcl-xl比值（0.73±0.07,P=0.001）小于对照组。免疫荧光检测结果显示,caspase-3、bax和bcl-xl的表达变化分别与其RT-PCR检测结果一致;正常对照组在视网膜各层均未发现凋亡细胞,MNU 1 d 组的外核层可检测到大量凋亡细胞核［凋亡率（AI）为34.96±3.44,P=0.000］,3 d 组的外核层检测的凋亡细胞最多（AI=76.97±5.83,P=0.000）,10 d 组未检测到凋亡细胞。结论 MNU诱导的视网膜光感受器细胞凋亡可能是通过上调caspase-3及引起bax/bcl-xl表达失衡并明显倾向促进细胞凋亡造成的。     

活血化瘀汤对急性高眼压大鼠视网膜内质网应激的影响

目的 研究急性高眼压大鼠视网膜的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)以及活血化瘀汤对ERS的影响.方法 88只Wistar大鼠随机分为正常对照组(8只)、高眼压组(40只)、治疗组(40只).除正常对照组外所有大鼠均随机取一眼制作急性高眼压模型,治疗组在造模后给予活血化瘀汤(4 mL·d-1)灌胃,高眼压组和治疗组分别在造模后12 h、ld、3d、7d、14 d均等处死大鼠.HE染色观察各组视网膜组织结构变化,免疫组织化学染色观察视网膜GRP78、Thy-1表达变化,RT-PCR检测视网膜GRP78、Thy-1 mRNA变化.结果 光镜下见高眼压组视网膜早期水肿,后期萎缩;治疗组与高眼压组在各时间点的变化趋势相同,但程度均轻于高眼压组.免疫组织化学和RT-PCR结果显示高眼压组造模后12h,GRP78蛋白和mRNA的表达量迅速上调(0.291±0.012、1.534±0.143),与正常对照组(0.195±0.003、1.011±0.011)比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);造模后1d,表达量达到高峰(0.498±0.049、2.047±0.177);造模后3d迅速降低,但仍高于正常对照组,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).治疗组GRP78蛋白和mRNA表达量在造模后12 h(0.274±0.023、1.398±0.031)较正常对照组显著增多,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),较高眼压组低,但差异均无统计学意义(均为P＞0.05);造模后1d达高峰(0.432 ±0.042、1.641 ±0.164),但增加量均少于同时间点高眼压组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);造模后3d表达量降低(0.212±0.022、1.174±0.126),与正常对照组比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05),但低于同时间点高眼压组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).造模后7d、14 d三组间GRP78蛋白和mRNA的表达量差异均无统计学意义(均为P＞0.05).造模后14 d,高眼压组和治疗组Thy-1蛋白和mRNA的表达量均降低,但治疗组Thy-1 mRNA表达量(0.754±0.053)明显高于高眼压组(0.627±0.069),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ERS参与了急性高眼压视网膜损伤过程,中药活血化瘀汤对该损伤有保护作用,可能与其抑制ERS有关.     

大鼠视网膜组织缺血再灌注后视网膜内caspase-3的表达及意义

目的 在视网膜缺血再灌注模型上,观察再灌注后视网膜内caspase-3的动态变化,探讨caspase-3与视网膜细胞凋亡的关系.方法 结扎大鼠左侧颈总动脉1 h,然后再灌注,检测再灌注后1、6、12、24、48、72 h大鼠视网膜内caspase-3的水平及视网膜细胞凋亡平均发生率.结果 再灌注后视网膜内caspase-3的表达出现在光感受器细胞层,在再灌注后1、6、12、24、48、72 h caspase-3平均光密度分别为0.067±0.004、0.923±0.045、1.962±0.377、3.793±0.860、2.039±0.427、1.332±0.109,细胞凋亡平均发生率(%)分别为1.8±0.1,7.1±0.2,18.2±1.4,34.7±2.1,22.6±0.9,16.3±0.4.结论 再灌注后大鼠视网膜caspase-3表达与细胞凋亡呈现正相关,caspase-3可以促进视网膜细胞凋亡的发生.(中国眼耳鼻喉科杂志,2006,6347～349)     

丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用

目的　探讨丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用。方法　采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型,将24只成模大鼠随机分为丝胶治疗组和糖尿病模型组,每组12只,另取同周龄12 只正常大鼠作为正常对照组,成模后丝胶治疗组给予丝胶溶液空腹灌胃、糖尿病模型组及正常对照组给予等体积生理盐水灌胃每天1次,共35 d。药物干预后,检测3组视网膜组织中丙二醛（malondialdehyde,MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量;采用Western blot法检测视网膜核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）蛋白的表达,苏木素-伊红染色法观察视网膜形态结构。结果　各指标三组间整体比较差异显著（均为P<0.01）。丝胶治疗组大鼠视网膜中MDA含量、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平分别为（4.145±0.282）mmol·gprot^-1、0.232±0.027和0.761±0.058,较糖尿病模型组的（6.813±0.446）mmol·gprot^-1、0.334±0.024、0.994±0.084均显著降低（均为P<0.05）。丝胶治疗组大鼠视网膜中还原型GSH含量、Nrf2和HO-1蛋白表达水平分别为（78.518±4.317）mg·gprot^-1、0.591±0.054和 0.954±0.091,较糖尿病模型组的（59.890±5.932）mg·gprot^-1、0.351±0.044、0.585±0.054均显著升高（均为P<0.05）。糖尿病模型组大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜肿胀,神经节细胞可见空泡、水肿样改变,丝胶治疗组大鼠视网膜各层细胞形态较规则、排列轻度紊乱,病理变化较糖尿病模型组明显减轻。结论　丝胶可改善糖尿病视网膜氧化应激和炎症介质的损伤,延缓糖尿病视网膜病变发展。     

Nogo受体在早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用

目的:探讨Nogo受体(nogo receptor,NgR)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用及机制。方法:链脲佐菌素诱导SD大鼠DM模型,实验分4组,对照组;DM组;siNgR组:DM大鼠玻璃体内给予NgR反义核苷酸序列;siRNA空白组:DM大鼠玻璃体内给予阴性核苷酸序列。1mo后TUNEL染色检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡,试剂盒检测视网膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,Western-blot检测视网膜NgR及caspase-3含量。结果:对照组、DM组、siRNA空白组及siNgR组MDA含量分别为3.74±0.49,7.21±0.96,6.41±1.34及4.02±0.53nmol/mg prot。与对照组相比,DM组及siRNA空白组视网膜RGC凋亡增加,NgR及caspase-3表达上调,MDA含量升高(P<0.05),而siNgR组视网膜RGC数量、NgR及caspase-3表达、MDA含量较对照组均无明显变化(P>0.05)。结论:NgR表达增加是糖尿病RGC凋亡的重要原因之一,其机制可能与NgR诱导视网膜氧化应激、上调caspase-3表达有关。     

高海拔缺氧条件下大鼠视网膜的损伤机制

目的:通过观察大鼠视网膜组织形态改变、细胞早期凋亡率、caspase-3和p53的表达,探讨细胞凋亡在模拟高海拔缺氧条件下大鼠视网膜损伤机制的作用.方法:实验大鼠随机分为对照组和实验组.对照组为10只,饲养于海拔高度为1500 m的室内环境;实验组为60只,分为6组,每组10只,分别饲养于模拟的海拔高度为5000m的高原环境模拟实验舱中2、6、12、24、48、72h.各组大鼠处死后,每组分别采用苏木精-伊红染色观察大鼠视网膜病理形态的改变、免疫组化染色观察大鼠视网膜caspase-3和p53表达及流式细胞仪检测细胞早期凋亡率.结果:模拟的高海拔缺氧条件可造成大鼠视网膜的组织损伤,且缺氧时间越长视网膜病理损伤越明显.caspase-3和p53的表达于2 h检测到,随着缺氧时间增加,两者表达逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.05).视网膜细胞早期凋亡率随缺氧时间逐渐上升,48 h升高明显.结论:细胞凋亡可能参与模拟高海拔缺氧的大鼠视网膜损伤机制,并通过caspase-3依赖的凋亡通路发挥作用.     

磷酸化细胞外信号调节激酶1/2对糖尿病视网膜病变的作用

背景 糖尿病视网膜病变（DR）具有复杂的病理表现和发生机制,丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）参与高血糖对脑缺血损伤的作用,MAPK信号转导通路在DR发生和发展中的作用有待深入研究.目的 探讨DR与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的关系.方法 采用随机数字表法将60只SPF级8周龄SD大鼠随机分为对照组和糖尿病组,将枸橼酸缓冲液配置的链脲佐菌素（STZ）溶液按照60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射制备糖尿病大鼠模型,血糖＞16.7 mmol/L视为建模成功;对照组以同样的方法注射枸橼酸缓冲液.分别于造模后4周和12周处死大鼠并分离视网膜,采用苏木精-伊红染色法进行视网膜的组织形态学观察,采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜磷酸化ERK1/2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的相对表达量.结果 造模后4周和12周,糖尿病组大鼠血糖水平均明显高于对照组大鼠,差异均有统计学意义（t=14.174、13.771,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组大鼠平均体质量明显低于对照组;糖尿病组大鼠饮水量明显多于对照组,差异均有统计学意义（t=8.670、18.725,P＜0.05）.与对照组大鼠比较,造模后12周糖尿病组大鼠视网膜变薄,外丛状层水肿,视网膜神经节细胞（RGCs）层、内核层及视细胞层细胞数量减少.免疫组织化学检测可见,造模后4周和12周糖尿病组大鼠视网膜中GFAP阳性细胞数增加,相对表达量（A值）分别为3 197.1±13.1和7 202.0±56.8,均明显高于对照组的2 152.8±16.1和2 337.0±8.6,差异均有统计学意义（t=6.327、16.417,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组视网膜磷酸化ERK1/2相对表达量（A值）为2 850.6±2.4,明显高于对照组的1 274.6±1.3,差异有统计学意义（t=12.771,P＜0.05）.结论 ERKl/2信号通路参与STZ诱导的糖尿病大鼠的早期DR,可能与RGCs和视细胞的凋亡及Müller细胞活化有关.     

人脐血干细胞对大鼠部分性视神经损伤保护作用机制的研究

背景视神经损伤后将导致视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡,而凋亡的重要机制是内质网应激（ERS）,减弱ERS可能对RGCs起到保护作用。目的探讨ERS在大鼠视神经损伤中的机制及人脐血干细胞对大鼠部分性视神经损伤后RGCs的保护作用。方法采用40g自制夹钳夹持102只SD大鼠的左眼视神经制作部分性视神经钳夹伤动物模型,用随机数字表法将动物分为模型损伤组和人脐血干细胞组,每组51只,均取左眼为视神经损伤眼,右眼为正常对照眼。人脐血于细胞组大鼠左眼造模后立即将10川人脐血干细胞注入玻璃体腔。分别在造模后3、7、14、21、28d各处死3只大鼠,苏木精一伊红染色后光学显微镜下观察大鼠RGCs形态学的改变,并对存活的RGCs进行计数。在造模后3、12、24、48、72h及1周各处死6只大鼠,分别进行TUNEL法检测2组大鼠RGCs的凋亡率及逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测上述时间点GRP78 mRNA和CHOP mRNA在2组大鼠视网膜中的表达。结果模型损伤组和人脐血干细胞组随造模时间的延长,RGCs存活的数量明显下降,差异均有统计学意义（F目目=20．100,P=0．007）,与模型损伤组相比,人脐血干细胞组RGCs存活的数量下降缓慢。各时间点间模型损伤组及人脐血干细胞组RGCs存活的数量明显低于正常对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）,而人脐血干细胞组RGCs的数量明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。TUNEL检测表明,人脐血干细胞组在造模后24h内未见RGCs凋亡,而模型损伤组可见大量TUNEL阳性细胞出现,造模后48h～1周人脐血干细胞组RGCs凋亡率明显低于模型损伤组,差异有统计学意义（P〈0．01）。人脐血干细胞组视网膜GRP78 mRNA表达较强,CHOP mRNA表达微弱,与模型损伤组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论ERS参与了大鼠部分性视神经损伤后RGCs的凋亡机制,人脐血干细胞对大鼠部分性视神经损伤后RGCs起保护作用。     

CTGFsiRNA改善STZ诱导糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡

目的:探讨CTGF对糖尿病大鼠视网膜内细胞凋亡的影响。方法:将60大鼠分为对照组,糖尿病4,8,12,16wk组和干预组。糖尿病大鼠应用STZ腹腔注射诱导成模。干预组大鼠于糖尿病成模后16wk玻璃体腔注射CTGFsiRNA来造成CTGF基因的沉默。取各组视网膜组织,应用RT-PCR检测视网膜内的CTGF基因表达,Tunnel法检测视网膜凋亡细胞的情况。结果:糖尿病组视网膜内CTGF表达和凋亡细胞数较正常组明显增加。凋亡发生在建模后4wk,并随着时间的延长而加重,在24wk时,凋亡细胞数为25.8个/mm2。CTGF表达于8wk时出现升高,到16wk时升高更明显。CTGFsiRNA处理后凋亡细胞数明显降低。视网膜内CTGF和细胞凋亡之间具有明显的相关性。结论:CTGF参与了糖尿病视网膜早期病变的细胞凋亡机制,CTGFsiRNA有利于改善糖尿病早期视网膜由于凋亡所致的细胞丢失。