丝胶对糖尿病大鼠视网膜微血管的保护作用及其作用机制

背景 糖尿病视网膜病变(DR)是一种慢性炎症性疾病,并伴有微血管病变.研究证实丝胶具有抗炎和抗氧化功能,但其是否对DR早期的微血管结构和功能有保护作用目前仍不十分清楚. 目的 观察丝胶对糖尿病大鼠视网膜中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、Cx43表达的影响,探讨其对糖尿病大鼠视网膜微血管病变的防护作用.方法 将48只SPF级健康雄性SD大鼠按计算机数字随机分配法分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组,每组12只.糖尿病模型组、丝胶治疗组、羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠均采用链脲佐菌素(STZ)连续腹腔内注射3d并给予高脂饲料饮食法制备糖尿病大鼠模型,成模后分别用生理盐水、2.4 g/(kg·d)丝胶溶液和0.2 g/(kg·d)羟苯磺酸钙灌胃3个月.采用过量麻醉法处死大鼠并制备视网膜标本,采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜组织的形态学变化.分别采用Western blot法和逆转录PCR技术检测大鼠视网膜中ICAM-1、VCAM-1和Cx43蛋白及其mRNA的相对表达量,并对各组检测结果进行比较. 结果 正常对照组大鼠视网膜组织结构正常,糖尿病模型组视网膜可见内界膜肿胀或断裂,偶见突出于内界膜的毛细血管内皮细胞,视网膜神经节细胞(RGCs)数量减少,丝胶治疗组和羟苯磺酸钙阳性对照组大鼠视网膜内界膜轻度增厚,内外核层细胞排列稍欠规则.糖尿病模型组、丝胶治疗组和羟苯磺酸钙组阳性对照大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量较正常对照组大鼠均明显升高,而Cx43相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与糖尿病模型组比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1和VCAM-1蛋白相对表达量均明显降低(0.8343±0.032 l与0.918 9±0.042 4、0.7264±0.011 2与1.235 0±0.078 9),而Cx43相对表达量明显升高(0.133 1±0.015 3与0.039 2±0.002 0),差异均有统计学意义(均P＜0.05).与正常对照组比较,糖尿病组大鼠视网膜中ICAM-1mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显升高,而Cx43 mRNA表达明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与糖尿病模型组大鼠比较,丝胶治疗组大鼠视网膜中ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA相对表达量明显下降(0.716 3±0.008 6与0.956 8±0.012 5;0.393 7±0.035 0与0.477 9±0.020 6),而Cx43 mRNA表达明显升高(0.676 8±0.064 8与0.4308±0.1113),差异均有统计学意义(均P＜0.05),各组ICAM-1 mRNA、VCAM-1mRNA和Cx43 mRNA相对表达量的变化趋势与其蛋白表达相同. 结论 丝胶能够减轻糖尿病大鼠早期视网膜的微血管病变,从而对DR的发生和发展发挥防护作用,其机制可能是下调视网膜中ICAM-1和VCAM-1的表达以及上调Cx43的表达.     

糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其凋亡相关基因的表达

目的 确定早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡并观测凋亡相关基因（Bax、bcl-2）在早期糖尿病大鼠视网膜的表达。方法 选择健康成年Wistar大鼠40只,随机分成正常对照组（contrast group,CON）和糖尿病（diabetes mellitus)1个月（DM1）、3个月（DM3）及6个月（DM6）组。腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ)诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜血管辅片及切片,分别行TUNEL法和免疫组化ABC法染色,并对ABC法染色结果进行计算机图像分析。结果 TUNEL法标记的阳性周细胞核出现于DM3和DM6组,而内皮细胞见于DM6组,CON和DM1组未见阳性反应。TUNEL阳性反应细胞核染色质分布不均,表现为环形核、新月形核等典型凋亡细胞特征。ABC法染色：于CON及DM各组,Bax和bcl-2二基因的蛋白均在视网膜血管表达。随病程进展,其阳性反应强度逐渐增加。此外,bcl-2阳性反应在DM3组于色素上皮细胞出现。在DM6组进一步扩大到视杆内节和节细胞。而Bax在DM6组亦出现于细胞。结论 早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为凋亡,内皮细胞亦存在凋亡;Bax和bcl-2在早期糖尿病大鼠视网膜的表达增加。     

糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与caspase-3表达的关系

目的:观察糖尿病早期大鼠,视网膜神经细胞凋亡与caspase-3表达变化的关系。方法:健康雄性8周龄SD大鼠36只,建立糖尿病大鼠模型18只,正常对照18只。再各自分为4,8,12wk3组,每组6只大鼠。TdT介导DNA缺口末端的dUTP标记(TUNEL)法检测视网膜神经细胞的凋亡程度;免疫组织化学方法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测caspase-3mRNA表达情况。结果:正常对照组4,8,12wk大鼠均未见视网膜神经细胞凋亡。糖尿病组大鼠于建模后4wk即出现视网膜神经细胞凋亡,8wk和12wk大鼠视网膜神经凋亡程度较同期正常对照组大鼠均明显增强。神经细胞凋亡主要位于视网膜神经节细胞层及内核层。正常对照组4,8,12wk大鼠视网膜均未见caspase-3蛋白阳性表达,糖尿病组大鼠4wk即可见caspase-3蛋白阳性表达,8和12wk时表达增强。正常对照组4,8,12wk大鼠caspase-3mRNA表达RQ值分别为1.6±0.6,1.5±0.5,1.6±0.3;糖尿病组4,8,12wk大鼠caspase-3mRNA表达RQ值分别为5.7±1.2,12.6±2.3,14.3±2.1;较同期对照组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡可能与capase-3表达增强有关。     

丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用

目的　探讨丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用。方法　采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型,将24只成模大鼠随机分为丝胶治疗组和糖尿病模型组,每组12只,另取同周龄12 只正常大鼠作为正常对照组,成模后丝胶治疗组给予丝胶溶液空腹灌胃、糖尿病模型组及正常对照组给予等体积生理盐水灌胃每天1次,共35 d。药物干预后,检测3组视网膜组织中丙二醛（malondialdehyde,MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量;采用Western blot法检测视网膜核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）蛋白的表达,苏木素-伊红染色法观察视网膜形态结构。结果　各指标三组间整体比较差异显著（均为P<0.01）。丝胶治疗组大鼠视网膜中MDA含量、NF-κB和TNF-α蛋白表达水平分别为（4.145±0.282）mmol·gprot^-1、0.232±0.027和0.761±0.058,较糖尿病模型组的（6.813±0.446）mmol·gprot^-1、0.334±0.024、0.994±0.084均显著降低（均为P<0.05）。丝胶治疗组大鼠视网膜中还原型GSH含量、Nrf2和HO-1蛋白表达水平分别为（78.518±4.317）mg·gprot^-1、0.591±0.054和 0.954±0.091,较糖尿病模型组的（59.890±5.932）mg·gprot^-1、0.351±0.044、0.585±0.054均显著升高（均为P<0.05）。糖尿病模型组大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜肿胀,神经节细胞可见空泡、水肿样改变,丝胶治疗组大鼠视网膜各层细胞形态较规则、排列轻度紊乱,病理变化较糖尿病模型组明显减轻。结论　丝胶可改善糖尿病视网膜氧化应激和炎症介质的损伤,延缓糖尿病视网膜病变发展。     

磷酸化细胞外信号调节激酶1/2对糖尿病视网膜病变的作用

背景 糖尿病视网膜病变（DR）具有复杂的病理表现和发生机制,丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）参与高血糖对脑缺血损伤的作用,MAPK信号转导通路在DR发生和发展中的作用有待深入研究.目的 探讨DR与磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的关系.方法 采用随机数字表法将60只SPF级8周龄SD大鼠随机分为对照组和糖尿病组,将枸橼酸缓冲液配置的链脲佐菌素（STZ）溶液按照60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射制备糖尿病大鼠模型,血糖＞16.7 mmol/L视为建模成功;对照组以同样的方法注射枸橼酸缓冲液.分别于造模后4周和12周处死大鼠并分离视网膜,采用苏木精-伊红染色法进行视网膜的组织形态学观察,采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜磷酸化ERK1/2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的相对表达量.结果 造模后4周和12周,糖尿病组大鼠血糖水平均明显高于对照组大鼠,差异均有统计学意义（t=14.174、13.771,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组大鼠平均体质量明显低于对照组;糖尿病组大鼠饮水量明显多于对照组,差异均有统计学意义（t=8.670、18.725,P＜0.05）.与对照组大鼠比较,造模后12周糖尿病组大鼠视网膜变薄,外丛状层水肿,视网膜神经节细胞（RGCs）层、内核层及视细胞层细胞数量减少.免疫组织化学检测可见,造模后4周和12周糖尿病组大鼠视网膜中GFAP阳性细胞数增加,相对表达量（A值）分别为3 197.1±13.1和7 202.0±56.8,均明显高于对照组的2 152.8±16.1和2 337.0±8.6,差异均有统计学意义（t=6.327、16.417,P＜0.05）.造模后12周,糖尿病组视网膜磷酸化ERK1/2相对表达量（A值）为2 850.6±2.4,明显高于对照组的1 274.6±1.3,差异有统计学意义（t=12.771,P＜0.05）.结论 ERKl/2信号通路参与STZ诱导的糖尿病大鼠的早期DR,可能与RGCs和视细胞的凋亡及Müller细胞活化有关.     

叔丁基对苯二酚对2型糖尿病大鼠视网膜细胞的保护作用及其机制

背景 细胞凋亡是糖尿病视网膜病变(DR)中的重要机制之一,氧化应激、高糖等可启动细胞凋亡通路,从而造成细胞损伤.叔丁基对苯二酚(tBHQ)是一种抗氧化应激药物,但其在DR的发生和发展过程中是否发挥视网膜细胞的保护作用尚不明确. 目的 观察tBHQ对2型糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)及Bcl-2表达的影响,探讨tBHQ通过核因子-E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路对2型糖尿病大鼠视网膜可能的保护机制.方法 选取50只清洁级健康雄性SD大鼠.应用随机数字表法随机选取其中10只大鼠为正常对照组,以正常饲料喂养;其余40只大鼠采用高脂高糖饲料喂养4周后空腹12h,然后大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病模型.造模成功大鼠均衡分组,模型对照组大鼠继续给予高脂高糖饮食,tBHQ干预组大鼠于造模后1周在高脂高糖饲料中添加质量分数1％ tBHQ进行干预,各组大鼠分别于造模后4周和12周收集大鼠心脏全血,检测各组大鼠空腹血糖(FPG),血浆总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;采用放射免疫分析法检测各组大鼠空腹血清胰岛素(FINs)含量.采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中VEGF、bcl-2蛋白的表达分布;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法定量检测各组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA和VEGF mRNA的相对表达量. 结果 35只大鼠成功建立2型糖尿病模型.各组大鼠造模后不同时间点FINs含量总体比较差异均有统计学意义(F分组=22.480,P=0.000;F时间=7.636,P=0.008).各组间大鼠血浆FPG、TC、TG和LDL-C含量总体比较差异均有统计学意义(FPG:F分组=78.531,P=0.000;TC:F分组=28.049,P=0.000;TG:F分组=13.108,P=0.000;LDL-C:F分组=6.804,P＜0.05).免疫组织化学检测显示,Bcl-2和VEGF蛋白主要表达于视网膜各层的血管、视网膜神经节细胞(RGCs)层、内核层和外核层.各组间大鼠视网膜中VEGF和bcl-2蛋白的相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=11.805,P=0.000;bcl-2:F分组=22.943,P=0.000);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中bcl-2蛋白的相对表达量明显高于造模后4周,差异有统计学意义(P＜0.05).各组大鼠造模后不同时间点视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=79.220,P=0.000;F时间=6.090,P＜0.05;Bcl-2:F分组=105.000,P=0.000;F时间=13.170,P=0.001).其中造模后4周和12周模型对照组和tBHQ干预组大鼠视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,tBHQ干预组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于造模后4周,差异均统计学意义(均P＜0.05). 结论 tBHQ可通过下调视网膜中VEGF的表达和上调bcl-2的表达对DR发挥抗氧化损伤和抗凋亡作用.此外,tBHQ对糖尿病大鼠可能有降血糖、调节胰岛素、降血脂的作用.     

糖尿病大鼠视网膜中内质网应激蛋白的表达及意义

目的 检测内质网应激蛋白(bip)在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,探讨内质网应激在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用和机制.方法 Wistar大鼠随机分为4组:链脲佐菌素(STZ)致糖尿病大鼠3、6、9个月模型组及正常对照组,每组10只.采用腹腔注射STZ 60 mg/kg,制备大鼠糖尿病模型;分批处死,每只大鼠左眼免疫组织化学法检测视网膜组织中bip的表达,右眼半定量RT桺CR方法 检测bip mRNA的表达.结果 bip在正常大鼠视网膜组织中少量表达,主要分布于视网膜内核层和神经节细胞层,糖尿病3个月组bip在各层的表达量升高,6个月组表达最高.结论 bip参与了DR的发病机制,在早期糖尿病大鼠视网膜组织中,细胞的应激能力随糖尿病病程延长而增强.     

石斛多糖对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护作用及其机制

背景 糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制涉及多条通路,近年来炎症因子相关的通路学说在DR发病中的作用越来越受到人们的关注.研究表明,高糖环境下视网膜内肿瘤坏死因子-α(TN F-α)等促炎因子含量增加,从而加速视网膜中紧密连接蛋白的异常,导致血-视网膜屏障(BRB)破坏.研究发现石斛多糖可抑制TNF-α的高表达,但其在DR早期对TNF-α表达的影响尚不清楚. 目的 研究石斛多糖对糖尿病大鼠TNF-α诱导的BRB通透性异常及视网膜内紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、连接蛋白-5(claudin-5)表达的影响.方法 将50只清洁级成年SD大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高剂量石斛多糖组,每组10只大鼠,糖尿病模型组和低、中、高剂量石斛多糖组大鼠均采用链脲佐菌素腹腔内注射法诱导糖尿病模型.低、中、高剂量石斛多糖组于建模成功后6周按照分组分别用100、200及300 mg/(kg·d)石斛多糖灌胃,正常对照组和糖尿病模型组大鼠用生理盐水灌胃.干预后8周各组大鼠心脏灌注伊文思蓝并获取双侧眼球,分别进行相关指标检测,通过测定大鼠视网膜中伊文思蓝质量浓度评估大鼠视网膜渗漏量;采用Western blot法检测大鼠视网膜内ZO-1、occludin、claudin-5蛋白的相对表达量,采用ELISA法检测大鼠视网膜中及血清中TNF-α的质量浓度.结果 正常对照组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量分别为(12.68±1.30)、(30.45±2.60)、(22.12±1.15)、(17.99±1.00)和(21.49±1.00) μg/μl,糖尿病模型组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量明显高于正常对照组,低、中、高石斛多糖组视网膜伊文思蓝渗漏量明显低于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测显示,糖尿病模型组大鼠视网膜中TNF-α蛋白相对表达量为1.12±0.10,明显高于正常对照组的0.27±0.03,低、中、高石斛多糖组视网膜中TNF-α蛋白表达量明显低于糖尿病模型组,ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表达量明显高于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);ELISA法检测显示,糖尿病模型组大鼠视网膜和血清中TNF-α质量浓度明显高于正常对照组,低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜和血清中TNF-α质量浓度明显低于糖尿病模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同剂量石斛多糖组各指标的比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 石斛多糖可能通过下调糖尿病大鼠视网膜中TNF-α的表达和上调紧密连接蛋白的表达而改善糖尿病大鼠BRB通透性的异常.     

内质网应激与糖尿病鼠视网膜神经节细胞凋亡的研究

目的 探讨葡萄糖调节蛋白(GRP78/Bip)半胱天冬酶12(Caspase-12)在糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中的表达及其与RGCs凋亡的关系.方法 STZ法建立24只DM模型鼠,按饲养时间1个月、3个月分为DM1个月组和DM 3个月组,12只正常SD大鼠为对照组.TUNNEL法检测视网膜细胞凋亡及存在的部位;免疫组织化学、Western blot及RT-PCR方法检测视网膜GRP78、caspase-12蛋白及Mrna的表达.结果 DM 1个月组出现RGCs凋亡,DM 3个月组凋亡增加.GRP78蛋白表达于正常组,DM 1个月、DM 3个月组表达较正常组增加(P＜0.01);caspase-12在正常视网膜中不表达,DM 3个月组表达与DM 1个月组差异有统计学意义(P＜0.01).GRP78、caspase-12mRNA均随着DM病程表达升高.结论 DM大鼠RGCs的凋亡随着DM病程延长而增加,RGCs的凋亡可能存在着内质网应激途径.     

罗格列酮对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的　观察过氧化物酶体增生物激活受体-γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ-γ,ＰＰＡＲ-γ）激动剂罗格列酮对链脲佐菌素诱导的早期糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ,ＤＭ）大鼠视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）凋亡的影响,进而从分子学水平上阐明ＰＰＡＲ-γ激动剂对糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的保护作用,为预防及早期治疗ＤＲ提供一种新思路。方法　选择９０只健康的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为三组:正常对照组、ＤＭ＋罗格列酮组和ＤＭ组,进一步将每组大鼠分为给药后４周、８周和１２周三个时间点进行观察。采用一次性腹腔注射５０ｍｇ?ｋｇ－１链脲佐菌素的方法建立ＤＭ大鼠模型。自ＤＭ模型成模后第３天起,ＤＭ＋罗格列酮组大鼠每天给予罗格列酮３ｍｇ?ｋｇ－１灌胃,正常对照组和ＤＭ组每天给予等体积的生理盐水灌胃。于给药后４周、８周和１２周处死各组大鼠,处死前测各组大鼠的血糖和体质量,然后摘除左眼球制成眼杯,采用ＴＵＮＥＬ法测定各组大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡指数,并作对比。结果　给药后４周、８周和１２周,ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠血糖水平均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠的体质量均较正常对照组降低（均为Ｐ＜０．０５）。正常对照组大鼠ＲＧＣ层上仅见少量的凋亡细胞;各时间点ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数较ＤＭ组明显降低（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）。结论　外源性ＰＰＡＲ-γ激动剂罗格列酮能够抑制ＤＭ大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡,对早期ＤＭ大鼠视网膜具有保护作用,有望成为ＤＲ新的治疗手段。     

高糖对原代培养的视网膜神经节细胞中Toll样受体4表达的上调作用及其意义

背景 研究发现糖尿病性视网膜神经病变的发生早于糖尿病视网膜病变(DR),视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤是DR的早期特征性改变.研究表明,Toll样受体4(TLR4)在糖尿病大鼠视网膜中呈高表达,但TLR4与糖尿病性RGCs损伤的关系尚不明确. 目的 研究高糖对原代培养的大鼠RGCs中TLR4表达的影响,为糖尿病性视网膜神经病变的预防和治疗以及靶向药物研究提供依据. 方法采用木瓜蛋白酶消化法从出生后1 ～3d的SPF级大鼠视网膜中分离RGCs并进行纯化培养,采用免疫荧光技术检测RGCs特异性标志物Brn3a的表达以鉴定培养的细胞.将培养的细胞分为正常对照组及10、20、30 mmol/L葡萄糖组,分别于不同浓度葡萄糖培养后24 h及48 h收集细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定RGCs中TLR4 mRNA及其蛋白的相对表达量.结果 细胞接种后贴壁生长并呈近圆形,纯化培养后24 h细胞体积逐渐增大且呈聚集样岛状生长,可见突触和轴突.培养的细胞中Brn3a为阳性表达.葡萄糖培养后24 h岛样细胞群周边细胞轮廓不清,反光弱,葡萄糖培养后48 h部分细胞内结构消失,仅残留细胞轮廓,可见大量细胞碎片.细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4 mRNA相对表达量分别为0.945±0.237、1.180±0.193和0.827±0.213,培养后48 h分别为1.509±0.422、2.433±0.617和1.435±0.410,均明显高于正常对照组的0.600±0.099和0.724±0.302,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4蛋白相对表达量分别为0.442±0.147、0.626±0.128和0.330±0.153,培养后48 h分别为0.464±0.121、0.930±0.441和0.394±0.158,均明显高于正常对照组的0.090±0.050和0.094±0.070,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 高糖环境下大量体外培养的RGCs细胞内结构消失,同时细胞中TLR4表达量上调,提示RGCs中TLR4的过量表达可能与高糖诱导的RGCs损伤有关.     

蛋白酶体抑制剂对糖尿病大鼠视网膜病变激活核转录因子-κB信号通路及视网膜神经节细胞凋亡的作用

目的　观察泛素蛋白酶体抑制剂对早期糖尿病性视网膜病变(DR)中激活核转录因子（NF-κB）和其抑制性信号蛋白IκB激酶的降解调控作用,及其对视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响。方法　健康成年雄性Wistar大鼠40只,用数字随机法随机分为正常对照组（A组）、DR安慰剂组（B组）、DR+蛋白酶体抑制剂（MG132）低浓度干预组（C组）,DR+MG132高浓度干预组（D组）,每组10只大鼠。给药后6、8周,检测每组大鼠体重、血糖,并制备视网膜石蜡切片,采用免疫组织化学法分析NF-κB及其抑制性信号蛋白IκB在大鼠视网膜中的表达。采用原位凋亡检测（TUNEL）法分析RGC的凋亡情况。结果　NF-κB在B组表达较A组明显增强,D组表达强度较B组减弱;IκB在B组表达较A组明显减少,D组表达强度较B组增强;RGC凋亡在B组的表达较A组明显增多,D组表达强度较B组减少;差异均有统计学意义(P＜0.01)。C组NF-κB和IκB的表达强度及RGC凋亡与B组相比,差异均无统计学意义(P＜0.05)。结论　泛素蛋白酶体抑制剂MG132通过抑制 IκB泛素化降解,阻断NF-κB激活,抑制RGC的凋亡。      

P38丝裂素活化蛋白激酶信号通路阻断对糖尿病鼠早期血视网膜屏障和视网膜节细胞的保护作用

目的　观察阻断p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对糖尿病早期Wistar大鼠血视网膜屏障（BRB）和视网膜节细胞（RGC）的保护作用。方法　将60只大鼠分为正常对照组及糖尿病组,每组各30只大鼠。对糖尿病组大鼠进行链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型,血糖值＞16.7 mmol/L为模型建立成功的判断标准。正常对照组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸钠溶液作为对照。采用IgG渗漏法量化BRB功能破坏和血管渗漏,免疫组织化学法检测视网膜上caspase-3和 血管内皮生长因子（VEGF）的荧光表达。糖尿病鼠建模后2周,对实验组行玻璃体腔注射p38 MAPK抑制剂 SB203580,注射后6周检测caspase-3和 VEGF的荧光表达,caspase-3免疫荧光染色法计数RGC凋亡数量。采用SPSS 13.0应用软件进行统计分析。结果　正常对照组大鼠中,IgG 染色局限于血管腔内,几乎没有渗漏的迹象。糖尿病鼠建模后8周,IgG渗漏明显增加。SB203580璃体腔注射6周后的糖尿病鼠IgG 渗漏减少明显。荧光免疫组织化学及相对定量分析结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后的糖尿病鼠视网膜上VEGF荧光表达呈下降趋势,VEGF相对荧光量从糖尿病鼠8周时较正常对照组高2.9倍减少到仅高于正常对照组1.8倍,两者比较差异有统计学意义（t＝5.203,P＜0.01）。caspase-3免疫荧光染色法RGC凋亡计数结果显示,SB203580玻璃体腔注射6周后,caspase-3阳性节细胞凋亡数与未注射SB203580相比明显减少,两者差异有统计学意义（t＝5.731,P＜0.01）。结论　p38 MAPK抑制剂 SB203580能够减轻糖尿病早期血视网膜屏障的破坏和视网膜节细胞的调亡,提示p38 MAPK信号通路在糖尿病早期对DR的发展起着一定的作用。