结核分支杆菌ESAT-6DNA疫苗研究进展

结核分支杆菌引起的结核病是一种人兽共患的慢性传染病,短程督导化疗是治疗该病的主要措施,卡介苗是预防该病的唯一疫苗,但其免疫效果极不稳定。本文介绍了结核分支杆菌ESAT-6重组质粒：pJW-ESAT-6、pGEX-ESAT-6、pCD-ESAT-6、pMCT-ESAT-6-Ag85B、pJW-TPA-ESAT-6和pVAX-Ub-ESAT-6等DNA疫苗的构建及其免疫机制等方面的研究进展。     

结核分支杆菌重组38KDa蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的研究重组结核分支杆菌蛋白38KDa(rTPA38)的免疫学特性,以寻找特异性的诊断制剂。方法皮肤试验轮圈法:分别以HRV全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏豚鼠备用;以5IU国际37标准品PPD为阳性对照,0.2μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射48h观察红肿、硬结反应的纵横径。以rTPA为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中的特异性抗结核抗体。结果rTPA与PPD均可诱发豚3838鼠迟发型超敏反应(DTH),所产生的DTH反应与PPD相似,而对堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。238例肺结核病组、rTPA和PPD检测的灵敏度分别为65.1%、72.7%。健康献血员组、非结核38呼吸疾病组和卡介苗接种阳转者血清同时用rTPA和PPD检测,rTPA的特异性分别为95.6%、95.9%、383888.5%;PPD的特异性分别为91.8%、85.4%、68.7%。统计结果表明rTPA蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组,其38阳性率差异有显著性(P<0.05)。两者检测卡介苗接种阳转组的阳性率和血清抗体滴度差异有显著性(P<0.05)。结论rTPA38诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似。rTPA蛋白抗原有较高的特异性和灵敏度,是ELISA法的38可靠抗原,可替代PPD成为一种新的特异性诊断制剂。     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌

目的：建立双重ＰＣＲ技术快速鉴定的结核与非结核分支杆菌。方法：通过试验选择双重ＰＣＲ最佳反应条件,检测引物Ａ１,Ａ２和Ｂ１,Ｂ２扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对３４例结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果：引物Ａ１,Ａ２能扩增所试２４种分支杆菌,Ｂ１,Ｂ２仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增１２种非分支杆菌均为阴性。     

重组结核分支杆菌 38000 蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应

目的：研究重组结核分支杆菌38000蛋白诱发豚鼠迟发型超敏(DTH)反应的特异性及其作为皮试诊断品的可行性。方法：皮肤试剂轮圈法：将豚鼠分为5组、每组5只，分别为H37Rv全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏备用。生理盐水为阴性对照，5 IU国际标准品PPD为阳性对照。将0.2μg 38000蛋白质分别注入每只致敏豚鼠的背部双侧皮肤。于注射后24，48h分别测量红肿或硬结的纵、横径，并记录两者平均值。结果：PPD与所有受试分支杆菌致敏的豚鼠均产生较强的DTH反应。重组38000蛋白对结核分支杆菌致敏豚鼠所产生的DTH反应与PPD相似，而对堪萨斯和偶发分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。结论：38000蛋白诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似，而特异性高于PPD，可替代PPD成为一种新的特异性皮肤诊断试剂。     

结核分支杆菌MPT63抗原的表达及其血清学诊断价值的研究

目的：获得结核分支杆菌重组MPT63蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。寻找更有效的结核病诊断试剂,方法：应用基因工程技术表达,纯化MPT63蛋白,通过Western blotting和免疫双扩散试验春抗原性,通过斑点免疫试验,结明试验和结核病一步法检测血清中的抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-MPT63测序表明具有正确的编码序列,MPT63蛋白在大肠杆菌细胞内以可溶性蛋白的形式高效率表达,表达量占菌体总蛋白的40％左右,分子量的kDa,Western blotiing和免疫双扩散试验检测抗结核,抗体的阳性率分别为46．7％和50％,结核病一步法检测的阳性率为70％,结明试验的阳性率为80％,在34例正常血清中,MPT63和PPD斑点免疫试验检测抗结核抗体的阳性率分别为38．2％和35．3％,结论病一步法检测的阳性率也为23．5％,结论：pET24b-MPT63大杆菌工程菌能以可溶性蛋白的形式高效表达,重组的MPT63也许可作为结核病血清学诊断的一组抗原之一。     

结核分支杆菌免疫学诊断抗原的研究进展

近年来结核病在全球范围内叉死灰复燃，成为传染病的首位杀手。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病日益严重，呈回升趋势，全世界已有1／3人VI约20亿人感染了结核分支杆菌（MTB）每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病，早期诊断MTB感染的方法越来越显得重要。     

结核分支杆菌诊断抗原的研究进展

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分支杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病，是当今世界由单一致病菌引起的死亡率最高的疾病，严重威胁着人类健康。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、MTB耐药菌株的出现、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病日益严重，呈回升趋势。     

结核分支杆菌重组蛋白rps12的结构与功能预测

目的应用生物信息学分析软件预测结核分支杆菌重组抗原rps12的结构与功能。方法应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及DNAstar、Rasmol等软件包分析预测结核分支杆菌重组蛋白rps12的二级结构、三级结构;预测主要抗原表位等。结果经预测,该蛋白分子质量约为13849.2KDa,理论等电点为11.37,有6个抗原表位,其结构域位于1-34,35-124。结论生物信息学技术在结核分支杆菌rps12重组蛋白研究中有一定的理论和参考价值。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

结核分支杆菌Mtb8.4抗原原核表达质粒的构建与鉴定

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4基因的原核表达重组质粒,为其蛋白质的表达及免疫学研究打下基础.方法 PCR扩增目的基因,克隆到质粒pET-His T7启动子的下游,转化大肠杆菌TOp10F‘,进行重组子的筛选、鉴定.结果 Mtb8.4基因正向插入表达载体中,测序证实具有正确的读码框,基因序列与文献报道一致.结论重组原核表达质粒pET-His-Mtb8.4构建成功.     

含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6对结核性脑膜炎诊断价值的研究

目的运用免疫细胞化学方法检测脑脊液单核细胞内结核分枝杆菌早期分泌抗原（ESAT-6）,探讨其对结核性脑膜炎早期诊断的意义。方法选择31例结核性脑膜炎患者和37例非结核性脑膜炎患者,运用免疫细胞化学方法检测脑脊液单核ESAT-6抗原,同时进行脑脊液抗酸染色、结核抗体和腺苷脱氨酶（ADA）检测,然后比较各种方法的阳性率、敏感性和特异性。结果免疫细胞化学方法检测脑脊液ESAT-6（免疫优势抗原）抗原的阳性率较其它检测方法的阳性率显著增高（P〈0.01）,其ESAT-6抗原诊断结核性脑膜炎的敏感性和特异性明显高于脑脊液抗酸染色、结核抗体和ADA检测。结论检测脑脊液单核细胞内ESAT-6抗原对结核性脑膜炎的早期诊断具有重要价值。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

Expression and immunogenicity of recombinant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin strains secreting the antigen ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis in mice

Background Tuberculosis remains the leading cause of human death. Currently, Bacillus Calmette-Guerin （BCG） is the only available vaccine against tuberculosis but its efficacy is highly variable. Thus, developing new tuberculosis vaccines becomes an urgent task. In this study, we evaluated in BALB/c mice the humoral and cellular immune responses of recombinant BCG expressing the antigen ESAT-6 from Mycobacterium tuberculosis. Methods Escherichia coli-BCG shuttle plasmid named pDE22-esat-6 was constructed by inserting the BamHI/EcoRI digested esat-6 gene PCR product into the similarly digested parental plasmid pDE22. BCG cells were transformed with pDE22-esat-6, which was named recombinant BCG （rBCG）. BALB/c mice were immunized subcutaneously on the back with 100 μl normal saline containing 106 CFU of BCG or rBCG. They were sacrificed after 4 weeks to detect their humoral and cellular responses. Results There was no any significant differences in the growth characteristics between the conventional BCG and rBCG. In immunized mice, the IgG antibody titres of rBCG group were as high as 1：8000, which was significantly higher than that in BCG group （1：1400, P〈0.05）. The elicited IFN-γ, level of rBCG group was （1993 ± 106） pg/ml, which was also significantly higher than that in BCG group （（1463 ± 105） pg/ml, P〈0.05）. The splenocyte proliferation index of rBCG group reached 4.34 ± 0.31, which was higher than that of BCG group （3.79 ±0.24, P〈0.05）. Conclusion rBCG secreted expressing antigen ESAT-6 stimulated stronger humoral and cellular immune responses than BCG did, and, therefore may be the better vaccine against mycobacterium tuberculosis.