MTS1真核表达载体的构建和鉴定

多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物,使Rb蛋白磷酸化受阻,细胞不能由G1期进入S期,进而抑制细胞分裂增殖.为进一步开展消化道肿瘤防治研究,我们构建了MTS1真核表达载体,现报告如下.     

hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰真核表达载体.方法人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small interfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo;采用PCR、酶切和测序鉴定.结果成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

凋亡素基因质粒载体对人肝癌细胞的影响

目的探讨凋亡素基因表达对人肝癌细胞的影响。方法将凋亡素基因克隆入真核表达载体pEGFP-C2,构建成pEGFP-VP3 为了使EGFP和EGFP-VP3在人肝癌细胞中表达,用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染人类肝癌细胞系(HepG2),通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达、细胞生长及凋亡,用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。结果在HepG2/EGFP组细胞中,EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核,细胞形态无变化。与非转染细胞的自然凋亡相比,转染细胞中细胞凋亡没有增加。在HepG2/EGFP-VP3组细胞中,EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核,细胞核中EGFP-VP3颗粒逐渐变粗,细胞变得小而圆,最后成为碎片,Annexin V-PE染色显示细胞凋亡;HepG2/EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于HepG2/EGFP组和HepG2组(P<0.01)。结论 pEGFP-VP3转染人肝癌细胞后,凋亡素基因表达并导致癌细胞凋亡。     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.     

肝细胞癌高表达基因TPT1真核报告表达载体的构建及鉴定

目的构建TPT1真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,为进一步研究其功能奠定基础.方法通过PCR和酶切的方法获取具有黏性末端的TPT1基因的全长开放读码框,将其定向连入真核表达载体pEGFP-N3绿色荧光报告基因的氨基侧,构成pEGFP-N3TPT1的真核报告表达载体,通过酶切和测序鉴定TPT1的正确插入.结果酶切和测序均证实TPT1正确插入了真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1中.结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1.     

人促血管生成素-2基因真核表达载体的构建及测序分析

目的克隆促血管生成素-2（Ang-2）基因,构建携带Ang-2基因的真核表达质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2,鉴定并分析其基因序列。方法从人胎盘组织中提取组织总RNA,用RT-PCR方法扩增出Ang-2基因的全长eDNA,并克隆于含有HA2-标签（tag）的真核表达载体peDNA3．1上,酶切鉴定,质粒双向测序鉴定克隆的Ang-2基因。结果扩增出人Ang-2基因的全长eDNA,电泳结果显示扩增的Ang-2eDNA大小约1．5kb,双酶切鉴定和DNA双向测序证实获得正确的重组质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2。结论正确克隆Ang-2基因,成功构建其真核表达质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2,为进一步深人研究人的肿瘤血管生成机制及抗肿瘤血管生成治疗奠定了坚实的基础。     

HEV ORF3真核表达载体的构建、鉴定和真核表达

目的构建表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3-pXF2RH融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的L02细胞系。方法利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,HindⅢ/EcolⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pXF2RH真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pXF2RH。将阳性克隆用脂质体法转染L02细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定ORF3-pXF2RH融合蛋白的表达。结果真核表达质粒转染L02细胞,SDS-PAGE显示在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带。结论成功构建ORF3-pXF2RH真核表达质粒,在L02细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。     

APP基因真核表达载体的构建与鉴定

目的重组APP基因真核表达载体。方法采用定向克隆技术、脂质体转染和Nonhenblot杂交技术。结果在分别独立的反应中,PDGF启动子、APPcDNA、载体依摩尔比3∶3∶1及1∶1∶1同时连接,重组体利用脂质体介导转染SY5Y神经母细胞瘤细胞,Northernbolt杂交检测到瞬时表达。结论构建具有神经组织特异性的APP基因真核表达载体。     

APP基因真核表达载体的构建与鉴定

目的重组ＡＰＰ基因真核表达载体。方法采用定向克隆技术、脂质体转染和Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ杂交技术。结果在分别独立的反应中,ＰＤＧＦ启动子、ＡＰＰｃＤＮＡ、载体依摩尔比３∶３∶１及１∶１∶１同时连接,重组体利用脂质体介导转染ＳＹ５Ｙ神经母细胞瘤细胞,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｏｌｔ杂交检测到瞬时表达。结论构建具有神经组织特异性的ＡＰＰ基因真核表达载体。     

腺病毒介导的凋亡素、内皮抑素双基因对食管癌的实验研究

目的探讨携带有凋亡素(vp3、Apoptin)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体在食管癌等多种肿瘤细胞内的表达情况及致凋亡作用,为进一步的食管癌治疗应用研究打下基础。方法将已纯化的携带凋亡素和内皮抑素基因的腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-His感染食管癌细胞Eca-109、小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞LoVo提取各种细胞RNA,针对凋亡素、内皮抑素基因的表达进行RT-PCR检测,同时对感染腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-His、Ad-vp3的食管癌细胞通过流式细胞仪、Hoechst33258染色等方式进行细胞凋亡率的检测。结果 RT-PCR检测显示被感染的多种肿瘤细胞均可表达凋亡素、内皮抑素基因的mRNA,Ho-echst33258染色显示被Ad-vp3-IRES-sEndo-His感染的食管癌细胞出现凋亡形态学改变,用流式细胞仪测定时段最高凋亡率达47.7%,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论携带凋亡素及内皮抑素双基因的腺病毒载体能在多种肿瘤细胞中表达,感染食管癌细胞后,能有效诱导其凋亡且其致凋亡率高于仅携带凋亡素的单基因腺病毒载体。     

白纹伊蚊AL-100 30 ku蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku蛋白基因,并构建其原核表达载体。方法RT-PCR克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku的全长基因,设计简并引物,扩增白蚊伊蚊30ku的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体。结果成功克隆白纹伊蚊主要过敏原30ku基因并构建其原核表达载体。该基因含有长度为816bp的开放阅读框,编码271个氨基酸。该蛋白质的分子质量单位为28.33ku,等电点为4.04,编码序列与数据库中已知的白纹伊蚊30ku基因的同源性为99％。结论成功克隆了白蚊伊蚊主要过敏原30ku基因并构建了原核表达载体,为白纹伊蚊主要过敏原30ku蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础。     

Construction of eukaryotic expression vector of HBV x gene

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＣｈｒｏｎｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕ...     

大鼠AQP4基因表达载体的构建及在体内表达的观察

目的　克隆大鼠AQP4基因并构建其融合蛋白表达载体 ,以便载体在体内进行AQP4基因干预。方法　采用逆转录构建大鼠脑cDNA文库、聚合酶链反应 (PCR)扩增大鼠AQP4基因片断 ,选用绿色荧光蛋白 (GFP)为报告基因 ,将其构建到pcDNA3.1 Zeo(+)真核表达质粒中 ,同时在AQP4、GFP基因之间插入IRES片段 ,以构建AQP4 GFP融合蛋白。在脑立体定位仪下将经预先处理过的AQP4 GFP表达质粒注射到大鼠脑内 ,荧光显微镜下观测基因表达 ,免疫组织化学检测脑内AQP4表达水平的变化。结果　 (1)扩增出长度为 993bp的片段 ,为AQP4序列的全段 ,测序结果与基因Bank(U14 0 0 7)上报道的大鼠AQP4M1型基因序列相同。 (2 )注射实验质粒和对照质粒后 12h于注射点局部均可观察到GFP阳性细胞 ,高峰出现在 2 4h ,至 72h荧光明显减弱。转染实验质粒 2 4h后可明显提高脑内AQP4表达的水平。结论　克隆的大鼠AQP4基因和构建的AQP4表达质粒 ,在体内获得表达 ,该质粒可以用于干预体内AQP4基因表达的相关研究。     

阴道毛滴虫ap33基因克隆及其表达载体的构建

目的 研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体。方法 提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pLICm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与CenBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接。结果 阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp,,ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99％、97％、94％的同源性。结论 成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性。构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白。     

VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。