人细胞周期素D1和B1真核表达载体的构建及对HeLa细胞的转染

目的：构建人细胞周期素cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,并将其瞬时转染到HeLa细胞株中。方法：以HeLa细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增cyclin D1和cyclin B1基因编码的cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMV~（TM）-14真核表达载体,分别构建p3XFLAG-cyclin D1和p3XFLAG-cyclin B1重组质粒,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测细胞中FLAG融合蛋白的表达。结果：经酶切鉴定和Western印迹分析证实人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达分子量大小相符的重组蛋白。结论：成功构建了人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,为两种细胞周期素及其相关蛋白的功能研究奠定了基础。     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

[目的] 构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。[方法] 通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBax SN-IRES2-EGFP．转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。[结果] 成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。[结论] 成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感件之间的关系奠定了基础。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

Livin基因RNAi表达载体的构建及其沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并观察该载体对Livin基因表达的沉默效应.方法:设计并合成4个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pGCL-GFP慢病毒表达载体,转化,扩增后测序.以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列的特异性片段,连接,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG.将构建好的Livin基因过表达克隆质粒和不同靶点的RNAi表达载体质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染人人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果.结果:Livin基因RNAi的表达载体pGCL-GFP-shLivin和Livin基因过表达载体pdsRED2-N1-Livin的阳性克隆序列正确.人293T细胞Livin蛋白表达90%被阻断.结论:成功构建高效阻断Livin基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究Livin基因的生物学功能奠定基础.     

表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体并加以酶切鉴定。方法提取小鼠脾总RNA进行RT—PCR反应获基因，酶切真核表达载体得到目的基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，使用酶切方法加以鉴定。结果酶切所得片段与所需相符，经测序证明为所需载体。结论获得重组的逆转录病毒载体，为今后进一步的研究奠定基础。     

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础。方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体。通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达。结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac I线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac I线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP。将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达;通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达。结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础。     

人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列，并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定，并转染到工具细胞HEK293T中，提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位，最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中，酶切鉴定片断为387 bp，并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达，分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体，pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质，LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。     

SiRNA特异性抑制cyclin D1的表达及其shRNA表达质粒的构建

目的 研究siRNA （small interfering RNA）对cyclin D1基因表达的抑制作用及shRNA表达质粒的构建.方法 化学合成针对cyclin D1基因的siRNA,转染MCF-7细胞株;分别应用荧光定量PCR和免疫印迹检测cyclin D1 mRNA和蛋白的表达;合成特异性cyclin D1的RNA干扰寡核苷酸序列,采用克隆技术,将其插人Psilencer2.1-U6质粒表达载体,构建cyclin D1 shRNA（small hairpin RNA,shRNA）表达载体.结果 化学合成的siRNA转染MCF-7细胞,48 h 后cyclin D1基因和蛋白表达都明显降低;构建特异性针对cyclin D1的shRNA 表达质粒,酶切和测序结果显示,siRNA片段已成功插入Psilencer2.1-U6载体,载体构建成功.结论 siRNA可以有效抑制MCF-7细胞株中cyclin D1的表达,并成功构建其shRNA表达质粒.     

人体胰腺癌细胞株PANC-1中四环素可诱导的周期素D1表达抑制系统的建立

[目的]在人体胰腺癌细胞株PANC-1中建立一个四环素可调控周期素D1表达系统。研究抑制周期素D1对胰腺癌细胞的影响。[方法]反义周期素D1质粒通过两次稳定转染进入胰腺癌细胞株PANC-1细胞中，其表达调控系统采用Tet-Off系统（四环素调控系统）。通过抑制周期素D1表达对PANC-1细胞生长、集落形成能力以及周期素蛋白表达的影响，评价此系统的可调控性和有效性。[结果]通过第一次转染pTet—Off质粒，选择两个最佳表达克隆行第二次转染DTRE-反义周期素D1质粒，并通过免疫印记测定挑选出能在Tet—Off系统中最有效地表达反义周期素D1的克隆。通过Tet—Off系统对反义周期素D1的调控．发现周期素D1的表达抑制可明显地抑制胰腺癌细胞生长和集落能力，并可导致胰腺癌细胞形态学改变。其抑制作用与四环素调控浓度和时间有关。[结论]此研究在PANC-1胰腺癌细胞株中建立了一个高效、可诱导的反义周期素D1的表达系统。通过这个系统的建立，可进一步在体内和体外研究周期素D1的抑制对胰腺癌细胞的影响．并可结合其它治疗手段如化疗来探讨联合治疗在临床的潜在应用价值。     

cyclin D1、Rb和p16基因在食管早期癌组织中的表达及其相关性研究

目的探讨cyclinD1、Rb和p16基因在食管癌发生中的作用及其相关性。方法应用免疫组织化学S-P法检测cyclinD1、Rb和p16基因在19例食管早期癌、20例异型增生以及10例正常食管黏膜标本中的表达。结果cyclinD1在早期癌中的表达高于正常食管黏膜（P〈0．05）,Rb与p16在早期癌中的表达低于正常食管黏膜（P〈0．05）。结论cyclinD1、Rb、p16与食管癌的发生有关,他们的变化是食管癌发生中的早期事件,CDK4／cyclinD1／p16／Rb通路在食管癌的早期发生过程中可能起重要作用。     

Cyclin D1 in Breast Cancer

Cyclin D1 protein plays an important part in regulating the progress of the cell during the G1 phase of the cell cycle. The cyclin D1 gene, CCND1, is amplified in approximately 20% of mammary carcinomas, and the protein is over- expressed in approximately 50% of cases. This has led to intensive study to ascertain whether cyclin D1 is a biological marker in breast cancer; however, the clinical work has produced unexpected results. Work in cell lines and in transgenic mice indicate that CCND1 is a weak oncogene and it was expected that, like c- erbB-2, over-expression of cyclin D1 protein would be associated with a poor prognosis. Early immunohistochemical prognostic studies produced equivocal results but we, and others, have recently shown that strong staining for cyclin D1 is more likely to be seen in well differentiated, estrogen receptor positive carcinomas. Furthermore, we have found that over-expression of cyclin D1 is actually associated with a good outcome, both in terms of prognosis and response to endocrine treatment. Cyclin D1 is frequently over- expressed in ductal carcinoma in situ but not in benign breast disease, including atypical ductal hyperplasia; hence its expression appears to be closely linked with carcinogenesis. In order to help explain the apparent beneficial effects of cyclin D1 over- expression, a number of closely associated cell cycle proteins have also been evaluated, including the cyclin dependent kinase inhibitor p27, which blocks the activating effects of cyclin D1. Initial reports show that high levels of p27 are associated with a good prognosis and we have shown a positive association between p27 and cyclin D1 expression. These clinical results of cyclin D1 are an example of how information obtained from basic cell biology studies needs to be complemented by clinical studies to ascertain the true worth of a prognostic marker.     

载体介导的哺乳动物细胞RNA干扰技术与基因治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物在进化过程中,抵御病毒感染及由重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制.RNAi是由双链RNA引发的靶基因mRNA降解而导致基因转录后沉默的现象,研究者利用这一现象对要研究的基因进行抑制,从而形成了RNAi技术.RNAi具有特异高效的特点,因此该技术已在研究基因功能和进行基因治疗中得到广泛应用.RNAi的实现途径有多种,每种方式都各有优缺点.     

Cyclin D_1与肿瘤

CyclinD1为G1期细胞周期蛋白,调节细胞的增殖周期,其表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。     

靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

[目的]构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。[方法]针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。[结果]酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。[结论]成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。     

介导MDR1的RNAi腺病毒载体的构建

目的介导MDR1的RNAi腺病毒载体,探讨RNA干扰MDR1基因对人肝癌细胞的作用。方法根据MDR1mRNA序列构建表达MDR1mRNA特异的shRNA的腺病毒穿梭质粒pshuttle-MDR1。与腺病毒载体体内重组为pAd-MDR1后转染人肝癌细胞SMMC-7721,以FCM检测细胞表面膜蛋白P-gp表达阳性率,以共聚焦显微镜检测细胞内Rh123的潴留,WesternBlot检测P-gp蛋白量的变化。结果构建成pshuttle-MDR1经限制性酶切和PCR证实与设计一致,将pAd-MDR1转染肝癌细胞SMMC-7721后,FCM检测细胞表面膜蛋白P-gp表达阳性率为22.9%和30.8%,远低于对照组(85.8%)。WesternBlot经病毒感染的SMMC-7721/R的P-gp含量明显低于对照SMMC-7721/R,而与SMMC-7721/S细胞接近。结论成功构建了pshuttle-MDR1腺病毒载体,并有效干扰了肝癌细胞细SMMC-7721MDR1的表达。     

肺癌组织中细胞周期素D1的扩增与表达

目的 :研究肺癌组织中细胞周期素 (cyclin)D1的扩增和表达及其与肺癌临床病理特征的关系。方法 :采用免疫斑点法和差异PCR方法 ,对 4 0例肺癌组织及 4 0例正常肺组织进行cyclinD1蛋白表达与基因扩增研究。结果 :肺癌组织cyclinD1蛋白表达的阳性率为 6 5.0 % ,高于正常肺组织的 2 2 .5% ;肺癌cyclinD1基因扩增的阳性率达 55.0 % ,也显著高于正常肺组织的 17.5% ;肺癌cyclinD1的高度扩增和过度表达与肺癌的转移及分期密切相关。结论 :cyclinD1基因的高度扩增和过度表达状态在肺癌的恶性进展中起重要作用 ,可作为判定肺癌恶性度的重要参数之一。     

细胞周期素D_1与乳腺癌

细胞周期中G1 S相的转换是肿瘤细胞增殖的必要条件 ,细胞周期素 (cyclin)D1则是G1期进展的限速控制因素 ,故cyclinD1的表达与乳腺癌的发生发展密切相关。同时 ,cyclinD1在乳腺癌中的表达有助于评价乳腺癌的分期和分级 ,有助于乳腺癌治疗方案的选择及预后的判断。