一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。     

基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析

目的对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系。方法对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。结果与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11826nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有68nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5′端和3′端分别有76nt、526nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于（ESCA）基因型。     

我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建我国SAILS病毒BJ01株基因组全序列的cDNA克隆，为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法：根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点，利用DNAstar软件设计7对引物。然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体。结果与结论：已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆，经酶切鉴定和序列测定表明，所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列。     

1株保存的马雅罗病毒基因组序列测定及分析

目的对保存的WJBC株马雅罗病毒(MAYV)基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株的关系及追溯其可能来源。方法将MAYV基因组编码区分10段进行RT-PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。下载MAYV核苷酸序列,利用MEGA5.0软件构建系统进化发生树。结果与结论 WJBC株MAYV基因组核苷酸(nt)共11 429 nt,编码3679个氨基酸,其中5’端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1,nsP2,nsP3,nsP4;3’端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有26 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5’端和3’端分别有76、290 nt的非编码区。进化树结果显示,WJBC株马雅罗病毒与TRVL4675株MAYV亲缘性最高。     

1999年新分离的登革病毒福建株基因组非编码区的结构特征

目的：测定和分析我国登革2型病毒福建株（FJ－11）基因组非编码区（NCR）序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据。方法：从登革2型病毒感染C6／36细胞中提总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5′和3′端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定,利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测。结果与结论：我国登革2型病毒FJ－11株基因组5′和3′非编码区长度分别为96nt和454nt,具有黄病毒共有保守序列和二有结构。与登革2型病毒美洲基因型比较显示,5′NCR第69位核苷酸的改变对其二级结构有影响,3′NCR端约70nt能形成相同的保守结构,而前380nt呈现多处核苷酸的差异而导致峡谷者预测的二级结构差异较大,它们可能对病毒基因组RNA的复制起重要作用。     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.     

改进的锚定反转录PCR法克隆中国人庚型肝炎病毒3′末端基因

应用改进的锚定反转录ＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄＲＴ－ＰＣＲ）法，在总ＲＮＡ的３′端“加尾”，Ｏｌｉｇｏｔｅｘ提纯ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ，Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）－ａｎｃｈｏｒ引物合成第１链ｃＤＮＡ，ａｎｃｈｏｒ引物及特异引物进行“半巢式”ＰＣＲ，从献血员血清中扩增出ＨＧＶ３′末端基因片段。序列分析结果表明：此中国株ＨＧＶ３′末端基因序列与美国株存在较大差异，但阅读框架相似。用此方法克隆单链ＲＮＡ病毒基因组的３′末端。由于许多动物病毒和９０％以上的植物病毒均为单链ＲＮＡ基因组，故该技术也可应用于其它病毒基因组未知末端的基因克隆。     

LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建

目的：克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。方法：（1）以LRP16基因全长作为探针，在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3kb基因组DNA序列。（2）以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段，将分离纯化的PCR产物用T4DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连，转入JM109感受态化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，进行Kpn I和BamH I双酶切和巢式PCR鉴定。（3）将LRP16启动子－pGEM-T Easy载体再次酶切，纯化回收鉴定过的目的DNA片段，构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。结果与结论：长度为2．7kb的LRP16基因启动子克隆成功，并构建了LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源，搜索已知基因的启动子序列，可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.     

Poly（A）加尾-RNase H消化-RT-PCR法分析应激诱导生成5′端tRNA半分子

目的：建立一种简便、快速检测应激诱导细胞生成的5′端转移RNA（ tRNA）半分子的方法。方法提取应激诱导细胞RNA,用poly（ A）加尾酶在RNA分子3′端加尾后,加入与待测tRNA的3′端部分序列互补的简并DNA探针杂交,经RNase H消化与DNA探针互补的tRNA序列,再由oligo（ dT） n锚定引物进行逆转录获得互补DNA（ cDNA）,以5′端tRNA半分子和锚定引物的序列为PCR反应的上下游引物,PCR扩增检测5′端tRNA半分子。结果经poly（ A）加尾-RNaseH消化-RT-PCR-电泳等步骤,可以实现对5′端tRNA半分子的检测分析。结论 poly （ A）加尾-RNaseH消化-RT-PCR法的建立实现了5′端tRNA半分子的简便、快速检测分析,为tRNA半分子生物学功能研究和检测分析提供了工具。     

WJBC株盖塔病毒基因组序列测定及与其他甲病毒的系统进化关系

目的对WJBC株盖塔病毒（GETV）进行基因组序列测定,阐明其与已报道的GETV及其他甲病毒的关系。方法将GETV基因组编码区分12段分别进行RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化后连入pGEM-T easy载体,经转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接获得基因组序列。结果与结论 GETV基因组核苷酸共11 696 nt,编码3721个氨基酸,非结构基因编码2468个氨基酸,结构基因编码1253个氨基酸,结构基因和非结构基因之间有44 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5＇端和3＇端分别有78、411 nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与M1株盖塔病毒同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸序列同源性为99.2%。     

新分离呼肠病毒基因组片段S1全长cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆测序新分离呼肠病毒的S1全长基因组片段，并对其进行序列分析。方法：从接种呼肠病毒的L929细胞中提取病毒基因组，用改进的单引物扩增技术获得S1片段的全长cDNA克隆井测定其全序列。结果：新分离呼肠病毒的S1片段长1437bp，其核苷酸序列与已知的1—3型呼肠病毒标准株的同源性分另1为59％，61％和48％；推测的cr1序列与标准株的同源性分别为52％，60％和26％。结论：新分离呼肠病毒的S1片段与目前已知的分离株相比有很大差异，有可能是2型呼肠病毒的一个独立分支。     

河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VPI氨基酸序列同源性达100%.Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高.序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型.结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源.     

VEGF-C基因3′端未翻译区对荧光素酶表达的影响

目的构建小鼠血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因3′端未翻译区(3′UTR)的荧光素酶表达载体,利用双荧光报告系统观察VEGF-C基因3′UTR对荧光素酶基因表达的影响。方法通过PCR分别扩增小鼠Lewis肺癌细胞VEGF-CcDNA全长3′UTR(429bp)和一段312bp的编码区序列(CR),采用基因工程方法将PCR产物克隆至pTA2克隆载体,随后再亚克隆至荧光素酶报告基因载体(pGL3-Promoter)荧光素酶编码基因下游的XbaⅠ酶切位点,使用LipofectamineTM2000真核转染小鼠Lewis肺癌细胞,化学发光法检测荧光素酶的活性,定量RT-PCR检测荧光素酶mRNA水平。结果PCR成功扩增出与预期长度相符的小鼠VEGF-CCR(312bp)和VEGF-C3′UTR(429bp)。经酶切、测序鉴定,小鼠VEGF-C基因3′UTR和CR均插入到pGL3-Promoter的XbaⅠ位点,插入序列碱基组成和插入方向均正确,获得载体pGL3-VEGF-C3′UTR和pGL3-VEGF-CCR。荧光素酶报告系统和定量RT-PCR检测显示,与pGL3-Promoter组比较,pGL3-VEGF-C3′UTR转染组荧光素酶活性和mRNA水平均显著降低,而pGL3-VEGF-CCR组与pGL3-Promoter组之间无显著性差异。结论VEGF-C基因3′UTR可以抑制荧光素酶的表达。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

昆明犬细小病毒的PCR检测及VP2基因的进化分析

目的 自昆明某犬场病死犬心脏扩增犬细小病毒VP2基因并进行测序比对分析,了解其变异和进化情况.方法 从病死犬心脏提取病毒DNA进行PCR扩增,PCR阳性产物克隆至pMD18-T载体测序,并与已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析.结果 p1p2引物测序与国内外毒株核苷酸同源性在98.0%～100.0%之间,其中与KU739_09最高为100.0%;p3p4引物测序与国内外毒株核苷酸同源性在98.3%～99.6%之间,其中核苷酸同源性与KU739_09、02B9、08 - 5-WH和bj-3最高均为99.6%.系统发育分析表明本次犬细小病毒分离株在CPV-2a亚型的进化分支上.结论 从昆明病死幼犬心脏中检测出犬细小病毒,此细小病毒为CPV-2a亚型,并且和KU739_09、02B9、08-5-WH和bj-3遗传关系比较密切.     

SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA的构建与鉴定

目的:构建我国自行分离的SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,为阐明SARS病毒致病的分子机制奠定基础。方法:采用分段克隆的方法对病毒全基因组进行分段扩增和克隆,然后将全基因组各cDNA片段分别进行体外连接获得全长cDNA分子,并对其接头序列进行PCR扩增和测序鉴定。结果与结论:获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,对其接头处序列的测定结果表明,该全长cDNA分子为SARS病毒BJ01株的特异序列。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5''''端调控序列功能分析

目的克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.     

西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析

目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。