人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

间充质干细胞向肝细胞分化研究

目的探讨间充质干细胞在体外诱导分化为肝细胞后,细胞增殖能力和免疫抑制能力等干细胞生物学的改变。方法间充质干细胞在体外进行向肝细胞诱导分化培养,分化为具有部分成熟肝细胞功能的肝细胞样细胞,并对这些肝细胞样细胞继续培养。流式细胞仪检测细胞表型,BrdU法检测细胞增殖能力,与CD4⁺T淋巴细胞共孵育实验检测细胞免疫抑制实验。结果间充质干细胞分化为肝细胞后,虽然具备了部分成熟肝细胞的功能,亦丧失了间充质干细胞本身的一些特性;BrdU法测增值能力,其OD值从1.859±0.117降到1.24±0.103,抑制CD4+T细胞激活的能力从94.8%(100%-5.2%)降到68.8%(100%-31.2%)等;而且分化后的细胞处于不稳定的分化状态,继续培养后,其细胞生物学相关特性和功能均出现去分化的现象,比如增殖能力恢复到OD值为1.501±0.229,免疫抑制能力恢复到81.8%(100%-18.2%)。这种不稳定的状态,进入体内后,是否会增加突变或致癌的概率,仍需进一步的研究。结论间充质干细胞比其向肝细胞诱导分化后的细胞更具安全性,更适合肝病治疗。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

人羊膜间充质干细胞分离培养及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能〔1-2〕。目前研究最多的是骨髓MSCs,但其必须通过有创伤性的途径获得,而且随着时间的延长,干细胞数量明显减少〔3〕。因此,寻找更易获得、含量丰富且易于培养的MSCs来源,对MSCs的实验研究具有重要意义。本研究从人羊膜组织中分离纯化MSCs,为人羊膜间充质干细胞(AMSCs)的进一步研究及临床应用提供基础。     

5-氮胞苷诱导脐带间充质干细胞分化为心肌细胞表达cTnI的研究

目的 通过对5-aza诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞后行免疫组化检测cTnI表达,以确定心肌样细胞的形态结构.方法 取传2代hUC-MSCs,分别加入终浓度为2.5、5、10、20、40、80μmo1/L的5-aza,培养4周之后观察诱导后的细胞形态学的变化以及生长情况.在诱导后的第二周进行免疫组织化学染色检测cTnI的表达,并计算阳性细胞转化效率.之后采用RT-PCR技术,在诱导后的第1、2、3、4周,对hUC-MSCs的ANP、BNP、a-skeletal actin的基因表达进行检测.结果 5-氮胞苷诱导7d之后,细胞形态出现变化.细胞多呈现紧密生长、平行排列,细胞的体积逐渐增大,梭形细胞的比例逐渐下降.40 μmol/L,80 μmoL/L组细胞形态变化明显.4周时,40,80 μmol/L组诱导的细胞折光性降低、细胞活性减弱,并且出现死亡的细胞.诱导后2周,5、10,20,40,80μmol/L组hUC-MSCs可见表达阳性的cTnI.cTnI阳性染色细胞数率比较,10 μmol/L,20 μmol/L,40μmol/L,80 μmol/L组之间无明显差异,均明显高于5 μmol/L组(P＜0.05).RT-PCR检测到ANP、BNP、a-skeletal actin基因表达增加;10 μmol/L组基因的表达量在不同时间点与其他各组的基因量相比较在数值上均高于其他各组,且在大部分的时间点上差异有统计学意义(P＜0.05),仅少部分差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经5-aza诱导的人脐带间充质干细胞有cTnI表达,具有心肌细胞的特异的免疫组化表现.     

人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外诱导培养分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性。方法采用成年人hMSCs传代培养2～3代,经条件培养液诱导培养后,进行形态学观察及MTT实验,RT-PCR分析,蛋白质印迹实验,茜素红染色方法分析细胞矿化作用,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,骨钙素(osteocalcin,OCN)、RUNX2和BMPR2的检测。结果 hMSCs细胞,在诱导培养条件下,细胞碱性磷酸酶ALP活性明显增高,并出现了矿化结节。经过体外成骨诱导的hMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征。在矿化期骨钙素mRNA OCN表达升高,RUNX2和BMPR2蛋白表达增高。结论 hMSCs易于体外分离培养及扩增,体外成骨定向诱导的hMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征,可以定向分化为成骨细胞。     

人脐带间充质干细胞移植后在ATN大鼠的分布

目的观察DAPI标记的人脐带间充质干细胞经外周静脉移植后在ATN大鼠体内的分布。方法 SD大鼠120只随机平均分为三组。移植组:将总量900mg/kg庆大霉素,首次300mg/kg,12h后200mg/kg,余400mg/kg分两次每隔24h皮下注射,共3天,建立ATN大鼠模型,采用经尾静脉注射法移植人脐带间充质干细胞。模型组:造模方法同移植组。空白组:正常大鼠。分别于造模成功后1d、4d、1w、2w及4w处死大鼠,留取血液做生化检测,取肾组织荧光显微镜下观察人脐带间充质干细胞植入实验动物体内后的分布情况。结果移植组大鼠,肾组织仅在肾小管中见到DAPI阳性细胞,而肾小球中为阴性,且肾小管上皮荧光从1d持续至4w仍可见,但强度有减弱的趋势。结论 HUCMSCs移植后仅在肾小管中分布,但不同时间点分布比较逐渐减低。     

诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究综述

脐血间克质干细胞是指从脐带血中分离、培养出来的一种成体肝细胞,具有多潜能性,可以向神经细胞分化。临床研究发现,脐血间充质干细胞于神经损伤、神经退行性疾病、卒中等神经系统疾病临床治疗中具有显著功效。近年来,关于脐血间充质干细胞相关研究工作不断推进,取得了多项研究成果。本文着重针对诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞问题进行了分析总结。     

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体,将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量,鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内,分析细胞核型,对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似,外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4）,质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81）,核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。     

移植人脐带间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的两种方法比较

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)经颈静脉及经腹腔两种途径移植后在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠脑内的分布、分化情况,寻找简单易行且有效的移植途径。方法 RICE法制备7日龄新生大鼠HIBD模型,随机分组:HIBD组(n=10)、腹腔移植组(n=15)、颈静脉移植组(n=15),另随机取未造模的10只为正常对照组。造模后72h后分别对颈静脉移植组和腹腔移植组移植等量的hUCMSCs(1×106个/只),而HIBD组及正常对照组不移植。于移植后36d免疫荧光染色比较Dil标记的hUCMSCs移植后在各组大鼠脑中的分布情况;神经元前体细胞标记DCX特异性染色观察hUCMSCs移植后分化成神经元前体细胞的情况。结果移植后hUCMSCs能迁徙到脑组织中,能分化成神经元前体细胞。经颈静脉移植途径优于经腹腔移植(P0.01)。结论 hUCMSCs移植后可以在HIBD新生大鼠脑内存活,并向神经元前体细胞分化,对HIBD新生大鼠脑功能有修复作用,尤以经颈静脉移植明显。     

脐带间充质干细胞移植缓解肺泡细胞衰老的作用探讨

目的 探讨脐带间充质干细胞（UC-MSCs）移植对放射性肺纤维化（RIPF）、RIPF小鼠的肺内衰老细胞的作用。方法 C57BL/6小鼠单侧右肺接受17 Gy照射构建RIPF模型,照射后3个月尾静脉注射UC-MSCs,照后6个月取材,记录小鼠生存率、统计肺脏器比,苏木素-伊红（H&E）染色、Masson染色观察肺部结构及胶原沉积;qRT-PCR检测衰老分泌相关表型（SASP）表达情况;β-Gal免疫组化评估肺内细胞衰老;WB检测P53-P21、P16通路关键蛋白表达水平;组织免疫荧光检测肺内P21表达情况。结果 经UC-MSCs治疗的RIPF小鼠生存率较未治疗组升高,胶原蛋白沉积减少,塌陷增厚的肺泡结构改善;RIPF小鼠肺内增多的β-Gal阳性衰老细胞和高表达的SASP(IL-6、IL-8、IL-1β)在UC-MSCs治疗后均下降;UC-MSCs治疗降低了RIPF小鼠体内异常增高的P53、p-P53、P21、P16蛋白水平。结论 UC-MSCs可能通过抑制P53-P21及P16通路减轻纤维化肺内细胞的衰老,缓解放射性肺纤维化,有望用于放射性肺损伤的治疗。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

人脐血间充质干细胞预防博来霉素致大鼠肺纤维化效果

目的 探讨人脐血间充质干细胞(HUCBMSC)对博来霉素所致大鼠肺纤维化的预防性干预效果及可能机制.方法 取第2代HUCBMSC培养至第4代;取无特定病原体级5周龄雄性SD大鼠120只随机分为博来霉素组、干细胞干预组、地塞米松干预组和阴性对照组,每组30只.前3组分别经气管注入博来霉素建立肺纤维化模型,干细胞干预组造模后经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的HUCBMSC,地塞米松干预组造模后第1天开始连续腹腔注射地塞米松7d,阴性对照组经气管注入等体积生理氯化钠溶液,在第7、14、28天分别处死各组中的10只动物,肺组织行苏木精-伊红、马松三色染色,碱水解法测定肺羟脯氨酸的水平.结果 干细胞干预组第7、14、28天肺组织均可见Brdu标记的干细胞.3个时间点的博来霉素组肺羟脯氨酸水平呈逐渐升高的趋势,第28天达最高水平(P＜0.01).3个时间点干细胞干预组和地塞米松干预组的肺泡炎症及肺纤维化程度均分别较博来霉素组轻,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HUCBMSC可以定植于受损的肺组织中,并可能在肺纤维化早期有效减轻肺泡炎及肺纤维化.     

大鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜组织中迁移分化的研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜组织的迁移分化情况。方法:第2代雄性大鼠骨髓间充质干细胞行PKH26标记,实验组5只雌性大鼠尾静脉注射1×107/mlPKH26标记BMSCs 1 ml,对照组5只雌性大鼠尾静脉注射生理盐水1 ml。6周后切下子宫制成冰冻切片,荧光显微镜下观察标记细胞在子宫内膜组织的分布情况,并进行免疫荧光染色检测标记细胞角蛋白的表达。结果:实验组大鼠子宫内膜组织均可见标记细胞散在分布于子宫内膜组织中,腺上皮中少数标记细胞角蛋白染色阳性。对照组子宫内膜均未见标记细胞。结论:BMSCs可以迁移至子宫内膜,可以向腺上皮细胞分化,参与子宫内膜的增生。