荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

Objective To evaluate if fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) detection for Mycobacterium tuberculosis in blood or sputum culture can help tuberculosis (TB) diagnosis. Methods A total of 81 patients with a clinical diagnosis of tuberculosis but sputum negative were enrolled, 40 were tuberculosis group and 41 coexisting HIV were HIV-TB group. Blood and sputum were cultured for bacilli or L-forms of Mycobacterium tuberculosis, and FQ-PCR was used to detected bacilli DNA. Results For pulmonary tuberculosis group, 54.1 %(20/37) were positive for bacilli or Informs of Mycobacterium tuberculosis in sputum by FQ-PCR, 27.5% (11/40) were positive in blood culture, 22.5%(9/40) were positive in blood by FQ-PCR, and the total positive rate of blood was 42.5% (17/40). But for HIV-TB group, only 2 positive cultures were found in 10 sputum, the positive rate of blood culture was 7.3% (3/41), and the positive rate of blood was 17.1%(7/41) by FQ-PCR. There was no significant difference between two groups in the positive rate of Mycobacterium tuberculosis by FQ-PCR after blood cultures (P > 0.05). The total positive rates detected by FQ-PCR of sputum or blood cultures were 65.0% (26/40) and 22.0% (9/41) respectively, and there was significant difference between two groups( χ2 = 15.305, P < 0.01). Conclusions FQ-PCR for blood or sputum culture detection appears to be a useful method to diagnose TB in persons with or without HIV infection. The use of FQ-PCR significantly enhance the efficiency of the etiological diagnosis of sputum negative pulmonary tuberculosis.     

荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

目的 评价荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血及痰培养物中结核分枝杆菌的临床价值.方法 81例临床诊断为结核病的痰涂片阴性患者中,单纯肺结核40例(肺结核组),合并HIV感染的患者41例(合并感染组).患者的血、痰样本分别进行结核分枝杆菌及其L型培养,采用FQ-PCR技术检测血及痰培养液中结核分枝杆菌DNA.结果 肺结核组结核分枝杆菌痰培养FQ-PCR阳性率为54.1%(20/37);血培养阳性率为27.5%(11/40),血培养FQ-PCR阳性率为22.5%(9/40),血培养及其FQ-PCR总阳性率42.5%(17/40).合并感染组10例痰样本培养后2例FQ-PCR阳性;血培养阳性率为7.3%(3/41),血培养FQ-PCR阳性率为17.1%(7/41).合并感染组血培养物FQ-PCR阳性率(17.1%)与肺结核组(22.5%)相比,差异无统计学意义(P>0.05).两组痰与血培养物FQ-PCR总阳性率分别为65.0%(26/40)和22.0%(9/41),差异有统计学意义(χ2=15.305,P<0.01).结论 痰或血培养物FQ-PCR检测有助于提高结核或结核合并艾滋病患者的诊断,同时显著提高了痰涂片阴性肺结核患者的诊断.     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌检测中的应用价值

目的比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)与抗酸染色、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法对311例临床确诊的肺结核病患者和40例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌。结果FQ-PCR、抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的阳性率分别为47.0%(146/311)、28.3%(88/311)、35.4%(110/311),特异性分别为100.0%、100.0%、95.2%,以FQ-PCR检测的阳性率最高。结论FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测痰结核分枝杆菌异烟肼耐药效果的评价

目的评价通过检测结核分枝杆菌katG基因突变以诊断异烟肼耐药并检测结核分枝杆菌的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法收集临床诊断为肺结核病的患者痰样本,用已建立的荧光PCR方法进行检测,与常规痰涂片抗酸染色、分枝杆菌培养和传统比例法药敏试验比较,评价检测结核分枝杆菌敏感性和特异性及异烟肼耐药的特异性和敏感性。统计学分析采用χ2检验,P值<0.05为差异有统计学意义。结果荧光定量PCR共检测186份痰液样本,敏感性为84.47%,特异性为100.00%。在确诊病人的痰液中阳性检出率84.47%,明显高于痰涂片40.99%(χ2=46.44,P<0.01),痰培养40.37%(χ2=47.89,P<0.01),且差异有统计学意义。其中荧光PCR在菌阳痰液中检出率94.44%,涂阴培阴的痰液中检出率75.28%。与常规药敏试验结果比较,培养阳性的61份痰样本的药敏符合率96.72%(59/61),敏感性33.33%(1/3),特异性100.00%(58/58)。结论 TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速诊断痰液中的结核分枝杆菌及其异烟肼耐药性。     

实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用

<正>核酸扩增技术特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)可对不同来源的核酸进行定性检测,但需在PCR反应终止后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,这不仅无法准确定量,而且还容易发生交叉污染,产生假阳性。     

荧光定量PCR技术在痰结核菌检测中的应用

目的 比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术与痰涂片抗酸染色、改良罗氏培养法在检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值.方法 对240例临床确诊的肺结核病患者和107例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本分别应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌;另用FQ-PCR法检测14例非结核分枝杆菌DNA以评价该方法对非结核分枝杆菌检测的特异性.结果 FQ-PCR检测结核分枝杆菌的敏感性分别为52.1％ (125/240),明显高于抗酸染色法的24.2％ (58/240)和改良罗氏培养法的35.4％ (85/240),x2=39.36,P＜0.01;FQ-PCR法对14例非结核分枝杆菌检测结果全部为阴性,特异性为100％.结论 FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,并且可以有效地鉴别非结核分枝杆菌感染,在肺结核的临床实验室诊断上有重要的应用价值.     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.     

实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究

目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系,快速鉴定结核分枝杆菌。方法设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针,探针标记以JOE为报告基团,BHQ1为猝灭基团。优化反应条件,建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测方法。通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落,检验方法的特异性、重复性和灵敏度。结果肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线,CT均值31.35,标准差4.31。健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线。对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2.54%以下,检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性。结论建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法,具有良好的敏感性和特异性。     

荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用

目的建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法,评估其在肺结核的t临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针,建立荧光定量PCR方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养法和抗酸染色法检测168份疑似肺结核和5例确诊病人随访的痰标本,比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果该荧光定量PCR法能扩增巧6l1O基因片段（107bp）,序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列,方法的检测灵敏度为4copies／反应;而对偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟茵的样本扩增结果均为阴性,荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64．29％（108／168）、35．12％（59／168）和12．50％（21／168）,前者高于后两者（P〈0．叭）。对抗酸染色法和集菌培养法阳性的样本,荧光定量PCR法的灵敏度分别为100．00％（21／21）和96．61％（57／59）。对20份非结核病人来源的痰标本．荧光定量PCR方法检测结果均为阴性,符合率为100．00％。用荧光定量PCR检测方法对5例活动性肺结核病例治疗期间进行了动态检测,结果显示病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势（即0值增加）。结论该荧光定量PER方法具有快速、敏感和特异性高的特点,可以快速、及时获取病人服菇詹的治府时票曲瞑辟的詹蛙督导妊井撂蚀饺摇臣者舌亚拍I性J妻音、;,     

增菌荧光定量PCR检测痰及血液中结核杆菌的临床应用

目的:评价增菌荧光定量PCR(FQ-PCR)检测痰及血液中结核杆菌的临床应用价值.方法:对61例菌阴和难治性结核患者的痰液、血液以及增菌痰液、增菌血液分别进行FQ-PCR检测,比较相互之间的差异性.结果:痰液、增菌痰液FQ-PCR检测阳性率分别为27.87%(17/61)、40.43%(19/47),二者比较X2=3.92,P<0.05,差异有统计学意义.血液、增菌血液FQ-PCR检测阳性率分别为0(0/35)、22.5%(9/40),二者比较X2=8.94,P<0.005,差异有统计学意义.痰液总阳性率为45.90%(28/61),较血液总阳性率22.5%(9/40)高,二者比较X2=5.70,P<0.05,差异有统计学意义.结论:增菌FQ-PCR在菌阴性和难治性结核杆菌的检测中可作为结核病的辅助诊断之一.痰液FQ-PCR阳性率明显高于血液,但痰液、血液联合FQ-PCR检测可提高结核杆菌的检出率.     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的 建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法 嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果 该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论 TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。     

食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中副溶血弧菌污染的快速、准确的定量检测方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列设计合成副溶血弧菌FQ-PCR诊断试剂盒，研究其灵敏度、特异性，并应用于模拟食品样本检测。结果在31株不同菌株的检测中，8株副溶血弧菌结果均为阳性，而其他23株弧菌科及其他菌属的菌株均为阴性；纯菌条件下定量检测低限10cfu／ml；对模拟样本直接进行，检测低限为10^3cfu／g，经培养增菌后，检测低限则达到2cfu／g。结论该方法特异性强、敏感性高，操作简便快速，检验周期仅需36h，扩增与检测在封闭单管进行，可避免常规PCR方法易污染缺陷，具有很好的推广应用前景。     

实时荧光定量PCR检测EV71肠道病毒在不同类型样本中检测率的分析

目的 探讨肠道病毒71型(EV 71)检测方法和样本收集对检测结果的影响.方法 采集疑拟患者鼻咽拭子和大便样本,应用实时荧光定量PCR方法检测.结果 结果EV71型肠道病毒大便检出率为46.2％,鼻咽拭子为5.61％,大便的检出率明显高于鼻咽拭子;差异有统计学意义(x2=61.51＞x20.01.1,P＜0.01).结论 对HFMD的诊断建议首选采集粪便标本,应用实时荧光定量PCR方法进行检测,可减少漏诊率,提高灵敏度.     

实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属

目的建立荧光定量PCR方法,用于检测军团菌属特异性16S rRNA基因,并探讨广州地区军团菌属感染状况。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,对广东省中医院采集的532例肺部感染患者痰液标本进行检测。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属细菌检测结果均为阴性;检测灵敏度为102CFU/ml,临床检测532例肺部感染患者的痰液标本,荧光法检出军团菌阳性43例,阳性率为8.08%,16S rRNA PCR法加基因测序验证阳性率为7.71%,两者检测结果差异无统计学意义,表明其具有较好的符合性和等效性。结论 16S rRNA基因荧光定量PCR法检测患者痰液标本中军团菌属,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌属感染调查及快速检测。     

核酸纯化对蝎型探针定量PCR准确检测结核分枝杆菌DNA的必要性研究

目的探讨经煮沸、Chelex100树脂处理、核酸纯化三种方法平行处理的标本在进行结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测中的有效性,以得到标本的最佳处理效果。方法收集42例结核确诊患者的多种标本和14例非肺结核患者的痰标本,对其分别用上述3种方法平行处理后,采用蝎型探针荧光定量PCR法进行检测,并分析其结果。结果核酸纯化法处理的标本阳性检出率为100%,明显高于煮沸法57.14%和Chelex100树脂法52.38%(分别为P=0.0103,P=0.0233);尤其是外观呈血性和菌阴性的标本,采用核酸纯化法处理标本后检测所得结核DNA量较其他方法处理所得量高约1~2个数量级。结论标本的处理对于结核分枝杆菌蝎型探针荧光定量PCR检测十分重要,煮沸(裂解)法和Chelex100树脂法不适合用以处理临床标本,而应使用核酸纯化法。     

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法：利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果：该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies／μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论：该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。