海藻糖深低温保存外周血造血干细胞的可行性

背景：二甲基亚砜是目前造血干细胞深低温保存的经典保护剂，但其对细胞和患者均有一定的毒副作用。海藻糖是一种稳定的无毒副作用的非还原性双糖，已被广泛应用于红细胞、血小板和胚胎等的冷冻保存中。 目的：探讨海藻糖作为低温保存造血干细胞保护剂的可行性。 方法：外周血造血干细胞经重组人集落刺激因子动员后，用血细胞分离机采集连续单个核细胞，分为0.5 mol/L海藻糖组、1.0 mol/L海藻糖组、对照组。采用程序降温法液氮保存，冻存7 d后取出，立即置于40 ℃水浴箱内复苏。锥虫蓝拒染法检测细胞存活率；采用甲基纤维素半固体培养体系进行集落培养，计数粒-巨噬细胞集落形成单位的回收率；采用CD34-PE/CD45-FITC双标法，流式细胞仪检测CD34+细胞回收率。 结果与结论：与对照组比较，0.5，1.0 mol/L海藻糖组细胞存活率、粒-巨噬细胞集落形成单位回收率、CD34+细胞回收率均明显升高(P < 0.001)，且0.5 mol/L海藻糖组升高幅度尤为显著(P < 0.001或P < 0.01)。证实海藻糖对于短期内低温冻存的外周血造血干细胞有一定保护作用，浓度为0.5 mol/L的海藻糖保护冻存的造血干细胞效果较佳。 关键词：低温保存；粒-巨噬细胞集落形成单位；海藻糖；浓度；外周血造血干细胞；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.12.008     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响*★

背景：非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷，程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久，将两者合二为一简化流程已成功用于临床。 目的：观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。 方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组。采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存，通过透射电镜观察细胞超微结构变化，流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。 结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05)。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上，含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中，早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上，加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

保存方法对同种异体软骨移植物免疫原性的影响★

背景：异体软骨移植是治疗关节软骨缺损主要手段，寻找软骨组织保存方法来降低移植软骨的免疫原性已成为临床上关键性的技术问题。 目的：比较慢速梯度降温法、玻璃化法与60Co射线照射+梯度降温法对同种异体骨软骨移植物免疫原性的影响。 方法：将关节软骨块随机分为4组：新鲜组不采取任何措施；慢速梯度降温组给予程序降温法保存关节软骨；玻璃化组利用玻璃化溶液处理后保存；60Co射线照射+梯度降温组给予60Co射线照射后，再按程序降温法保存关节软骨。保存8，15，30，60 d后关节软骨块经细胞培养及扩增后制备成细胞悬液。流式细胞仪检测关节软骨细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ，Ⅱ抗原表达率。 结果与结论：经过保存后，慢速梯度降温组、玻璃化组和60Co射线照射+梯度降温组细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ抗原表达率有大幅下降，与新鲜组相比有显著性差异，但前3组间没有显著性差异。各保存组主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原和主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原表达率均随着时间的推移下降，并且在30 d时3种不同保存方法保存的软骨细胞表面主要组织相容性复合体表达率就降低到最低。预示着经保存处理的关节软骨可能会提高同种异体骨软骨移植手术的成功率。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较*

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中，受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响，各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。 目的：比较-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。 方法：将采集的造血干细胞分两组，第一组细胞浓度为1×1011 L-1，加入10%二甲基亚砜，放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4 ℃按1 ℃/min的速率降温，按35 ℃/min快速降至-45 ℃，再以15 ℃/min升至-21 ℃，然后以5 ℃/min降至-90 ℃，取出冷冻管置-196 ℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011 L-1，加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白，将冷冻管置-80 ℃冰箱过夜后取出，置-196 ℃液氮罐内的气相，再过夜后置液氮罐液相内。 结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂，通过-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果，操作简便易于临床应用。     

震荡热管技术在生物材料低温玻璃化保存中的应用

玻璃化保存是一种新的低温保存方法，可通过提高保护剂浓度或增大降温速率两个途径实现溶液的玻璃化，但高浓度的低温保护剂会对细胞产生毒性损伤和渗透压损伤，因此一般需要快速的降温速率来实现玻璃化。震荡热管具有强化传热的性能，本文综述了国内外震荡热管的研究现状，讨论了其提高降温速率的技术路线，并分析了应用于玻璃化保存的可行性。震荡热管为细胞的玻璃化保存提供了很好的技术支持。     

海藻糖对低温保存胸骨中bcl-2和bax基因表达的影响*

背景: 研究已经证实海藻糖对低温保存中的胸骨具有保护作用,但作用途径尚不清楚。 目的：观察海藻糖对低温保存胸骨bcl-2和bax基因表达的影响。 方法：新鲜配置4组保存液：低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组、低钾右旋糖酐＋海藻糖组、低钾右旋糖酐＋二甲基亚砜组＋海藻糖组。切取SD大鼠胸骨后立即分别放入含上述4 种溶液的冻存管中低温保存。抽取新鲜大鼠胸骨组织和低温保存120 d的4组标本,采用RT-PCR方法检测不同保存液保存的胸骨及新鲜胸骨bcl-2和bax基因mRNA表达量。 结果与结论：低钾右旋糖酐+海藻糖组bcl-2表达量高于低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组(P < 0.01),但bax表达量低于低钾右旋糖酐组、低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组(P < 0.01);低钾右旋糖酐+二甲基亚砜组+海藻糖组bcl-2表达量最高,bax表达量最低,基本接近新鲜骨组织(P > 0.05)。结果提示海藻糖可能通过增强bcl-2基因、抑制bax基因的表达保护低温保存中的胸骨细胞活性,其与二甲基亚砜合用保护作用更好。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景：细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据。 目的：用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成。 材料：体质量150 g左右成年SD大鼠。海藻糖由Sigma公司提供。 方法：通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4 ℃、4~37 ℃(相转变)和37 ℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件。将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1 ℃/min的速率降温至-80 ℃后移入冷冻干燥机中进行冻干。将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照。以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植。 主要观察指标：海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况。冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况。 结果：海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P < 0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著。孵育温度为37 ℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4 ℃组(P < 0.05),相转变组与37 ℃组差异无统计学意义。皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P < 0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加。实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37 ℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤。冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状。水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别。冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤 (P < 0.05)。冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d。 结论：海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37 ℃,孵育时间为 7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件。     

玻璃化法和低温冷冻法保存兔股动脉活性的差异

背景：异体血管保存常用的低温冷冻法会不可避免地形成大量冰晶，因此所保存的血管活性有限。玻璃化法可避免冰晶所造成的挤压损伤和冻融效应，尤其适合于活性组织的保存。 目的：比较玻璃化法和低温冷冻法保存兔股动脉组织结构和收缩舒张能力的差异。 设计、时间及地点：组织形态学及力学水平的随机对照实验，于2002-09/2006-08在解放军总医院骨科研究所完成。 材料：纳入新西兰兔18只，按随机数字法分为3组，玻璃化法保存组、低温冷冻法保存组及新鲜血管组各6只，每组取12条股动脉。 方法：切取股动脉标本，置于平衡液中备用。玻璃化法保存组血管在4 ℃条件下经25%，50%和100%梯度玻璃化溶液浸泡后，直接投入液氮中。低温冷冻法保存组血管由常温状态下，经过0，-20，-70 ℃梯度降温，平衡60 min，直接投入液氮中。将新鲜动脉作为对照，样本在液氮中保存14 d 以上。 主要观察指标：对动脉组织进行细胞培养和鉴定，测定动脉环张力随去甲肾上腺素和硝普钠剂量的变化。 结果：3组动脉培养均为平滑肌细胞，玻璃化法保存组生长速度与新鲜血管组相近，而优于低温冷冻法保存组。玻璃化法保存组与新鲜血管组动脉环最大收缩力差异无显著性意义（P > 0.05），玻璃化法保存组、新鲜血管组动脉环最大收缩力显著大于低温冷冻法保存组（P < 0.01）。当去甲肾上腺素剂量为10-6 mol/L时，动脉开始明显收缩；当去甲肾上腺素剂量为10-4 mol/L时，动脉收缩力达到最大。玻璃化法保存组、低温冷冻法保存组及新鲜血管组动脉环最大舒张程度差异无显著性意义（P > 0.05）。当硝普钠剂量为10-7 mol/L时，动脉开始产生明显的舒张反应；当硝普钠剂量为10-4 mol/L时，动脉基本达到最大舒张程度。 结论：玻璃化法保存的动脉较低温冷冻法具有更多的活性平滑肌细胞，尽管玻璃化法保存的动脉在对去甲肾上腺素的收缩能力方面优于低温冷冻法保存的动脉，但是对硝普钠的舒张能力上二者之间没有差别。     

胶原酶消化时间及质量浓度对大鼠胰岛细胞分离的影响*★

背景：胶原酶消化方法是胰岛细胞分离技术中关键的第1步，其成败关系到胰岛细胞移植的存活与功能。 目的：针对不同质量浓度和同一质量浓度条件下不同时间点胶原酶分离纯化所获得胰岛细胞的效果进行对比，以确定理想的胶原酶分离胰岛细胞的标准化方案。 设计、时间及地点：单一样本观察，细胞学体外观察，于2006-09/2007-05在解放军总医院第二附属医院全军器官移植实验室完成。 材料：胰岛细胞供体为SD大鼠。将32只大鼠按随机数字表法分为4组，即胶原酶0.5 g/L，1.0 g/L，1.5 g/L及2.0 g/L组，每组8只。 方法：每组前4只动物，采用0.5，1.0，1.5，2.0 g/L 4种质量浓度的胶原酶对胰腺进行分离，消化过程中每隔10 min为1个时间点，双硫腙染色观察分离情况，分析结果并确定最适合获取胰岛量最多的时间点。随后每组另外4只动物按照确定时间点停止消化，应用间断密度梯度离心法纯化胰岛，双硫腙和丫啶橙-碘丙啶荧光染色分析移植物形态和存活率，确定分离所需胶原酶的最佳浓度。 主要观察指标：调整胶原酶的质量浓度与消化时间，荧光显微镜下胰岛细胞计数，评估胶原酶最佳质量浓度及消化时间。 结果：分析后确定各组胰岛细胞最佳获取时间，胶原酶0.5 g/L组50 min，胶原酶1.0 g/L组40 min，胶原酶1.5 g/L及 2.0 g/L组均为30 min。胶原酶0.5 g/L组分离并纯化后胰岛细胞收获量显著低于其他3组(P < 0.01)，胶原酶1.0 g/L，1.5 g/L及2.0 g/L组两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。胶原酶2.0 g/L组胰岛细胞平均存活率显著低于其他3组(P < 0.01)，胶原酶0.5 g/L，1.0 g/L及1.5 g/L组两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：在胰腺灌注良好情况下，胶原酶消化条件控制在质量浓度1.5 g/L，时间30 min进行水浴振荡可获得很好的分离效果。     

40000/微囊化细胞低温保存的研究进展

背景：微胶囊是一种有效的免疫隔离工具,低温冷冻方便了微囊的保存与运输,有利于微囊化技术在临床的推广应用。 目的：综述微囊低温保存技术中微囊低温保存特点、不同保存方法优缺点、研究方法及微囊低温保存实验现状,提出其中存在的问题,并对其发展进行展望。 方法：1980/2010 PubMed数据库（网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）,1991/2010万方数据库（网址http://www.wanfangdata.com.cn）,维普数据库（网址http://www.vmis.net.cn/yixue/index.asp）,有关微囊低温保存研究,低温保存工艺理论及专用仪器,微囊低温保存技术医学应用的文献,英文关键词为“microencapsulation,microencapsulated cell,cryopreservation,transplantation”。中文关键词为“微囊化细胞,低温保存”。 结果与讨论：微囊化细胞在低温保存过程中的损伤特点与细胞、组织有很大不同。微囊相对较大的尺寸与复杂的囊壁半透膜结构,使得微囊结构与囊内细胞更容易受到溶质损伤与冰晶损伤,因此不能简单的套用单细胞悬液的低温保存方案。慢速冷却法与玻璃化法是两种常见的微囊化细胞低温保存方法,各有利弊。微囊化细胞低温保存技术尚未成熟,在开发新型微囊低温保存设备,优化设计微囊低温保存方案的同时,需进一步加强对微囊冻存机理的更深层次的探索。