宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的DNA改组

目的 利用DNA改组技术进化人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因,建立HPV16E7基因突变体库.方法 从宫颈癌标本中扩增出HPV16E7基因,用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)碎片化该基因,切割成50 bp左右的小片段.这些小片段在不外加引物的条件下,利用PCR反应进行重聚,再将重聚物经过一轮普通PCR扩增.结果 电泳切胶回收获得与原片段大小相当的基因片段,改组结果较为成功.结论 DNA改组在HPV16E7改组中的应用并成功,有利于从HPV16E7基因突变题库中筛选出高免疫原性的基因型别,并为进一步构建HPV治疗性疫苗奠定基础.     

口腔白斑和鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒感染分析

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)16/18感染与口腔鳞状细胞癌(OSCC)临床病理特征间的关系.方法 原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)分别检测10例正常口腔黏膜,26例口腔白斑(OLK)和56例OSCC中的HPV16/18水平,分析不同组间HPV16/18阳性率间的差异和OSCC中HPV16/18感染与性别、年龄、TNM分期、组织学分化、淋巴结转移、吸烟的关系.结果 ISH和IHC检测HPV16/18阳性率差异无统计学意义(P＞0.05);OSCC和OLK患者中HPV16/18阳性率高于正常口腔黏膜(P＜0.05);OSCC中吸烟者HPV16/18阳性率明显高于非吸烟者(P＜0.05).结论 HPV16/18感染是部分OSCC的发病因素,其与吸烟对OSCC发病具有协同作用.     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物进５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

口腔鳞状细胞癌与人乳头状瘤病毒感染的关系

本文用抗牛乳头状瘤病毒（ＢＰＶ）的抗血清对３１例口腔鳞状细胞癌中的人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）结构抗原进行检测，证明其中３０例口腔鳞状细胞癌中ＨＰＶ结构抗原阳性，说明口腔癌的发病与ＨＰＶ感染有密切关系，防治ＨＰＶ感染，对减少口腔癌的发病有极其重要意义。     

宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型DNA序列的检测

应用DNA斑点分子杂交技术检测了54例宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型DNA序列,并应用DNA Southern印迹杂交技术分析了部分斑点杂交阳性的标本。结果表明,50%的宫颈癌标本中HPV16DNA阳性,而在18例正常宫颈组织中未测到HPV16DNA序列;Southern印迹杂交发现HPV16DNA以整合状态存在。提示HPV16与宫颈癌的发生密切相关。     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型转化基因E7的检测

用聚合酶链反应扩增宫颈癌组织中人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因，获得含完整Ｅ７基因的３１２ｂｐ片段。分析２２例宫颈癌样品，Ｅ７基因的检出率为４５．５％，４０例宫颈炎中Ｅ７基因的检出率为５％。这一方法为进一步研究Ｅ７基因在宫颈癌发生中的作用奠定基础，并可用于宫颈癌的诊断与防治。     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

实时荧光定量PCR和RT-PCR检测宫颈癌细胞株HPV-16 E6和E7基因的实验研究

目的 探讨实时荧光定量PCR和RT-PCR检测HPV-16 E6和E7基因的实验方法.方法 将制备的含HPV-16 E6和E7基因的质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别对3种宫颈癌细胞株进行HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数的定量检测.结果 建立的实时荧光定量PCR标准曲线相关系数大于0.99,PCR效率在90%以上.HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数在宫颈癌细胞株 CaSki、SiHa和HeLa中从高到低依次是CaSki＞SiHa＞HeLa.结论 用实时荧光定量PCR和RT-PCR方法研究HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA含量结果可靠,为进一步研究两个基因与宫颈病变的关系奠定了基础.     

ICAM-1在口腔鳞癌中的表达

目的：探讨细胞间粘附分子 １（ＩＣＡＭ １）在口腔鳞癌中的表达及意义。方法：用ＡＰＡＡＰ免疫组织化学方法检测ＩＣＡＭ １在３７例口腔鳞癌原发灶及９例转移淋巴结中的表达,并分析其与临床参数的关系。结果：原发肿瘤最大直径≥３ｃｍ,仅５例弱表达;直径＜３ｃｍ,７８９％（１５／１９）表达。９例有区域淋巴结转移的原发灶及转移淋巴结均不表达ＩＣＡＭ １;无转移的原发灶７１４％（２０／２８）表达。高分化鳞状细胞癌８３３％（１５／１８）表达,中分化仅５例弱表达,低分化不表达。结论：口腔鳞癌在其生长分化的不同阶段,肿瘤细胞可能呈现不同的粘附特征,ＩＣＡＭ １在口腔鳞癌中的表达可能与其分化程度、侵袭转移有关。     

Detection of Human Papillomavirus Type 16 DNA in Cervical Carcinomas

Accurate typing of the different human papillomavirus types is csscntial in view of the differ-ent pathological potential of the common virus types of human papillomavirus (HPV) present in thecervix. We have developed hybridization, washing and autoradiography conditions that minimize thecross-hybridization among different specific types of HPV so as to allow clear - cut type assignmentthrough practical dot blot hybridization technique using nylon membrane and ~(35)S - labeled HPV - 16DNA probe. Under these conditions seventeen of thirty (56.7%) of squamous cell carcinomas of thecervix uteri obtained from Tianjin women were detected in the presence of HPV - 16 DNA.     

口腔鳞癌组织中Survivin的表达

目的 :观察口腔鳞癌组织中Survivin的表达 ,探讨Survivin在口腔鳞癌中的作用。方法 :收集口腔鳞癌标本 4 2例 ,其中有淋巴结转移者 14例 ,10例正常口腔黏膜组织 ,用免疫组织化学染色法探测Survivin的表达情况。结果 :正常口腔黏膜均未见Survivin表达 ,口腔鳞癌中Survivin表达阳性率为 80 95 % (34/ 4 2 ) ,Survivin表达阳性率与淋巴结转移有关 (P <0 0 5 ) ,未见与组织学分化程度、临床分期、年龄和性别相关 (P >0 0 5 )。结论 :Survivin在口腔鳞癌组织中的高度表达在口腔鳞癌发展中起重要作用 ,并与其淋巴结转移关系密切     

HPV16 E_7基因克隆及其特异性鉴定

根据已报导的ＨＰＶ１６Ｅ_７基因序列，设计了两个寡核苷酸引物，在引物的５′端分别引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增了ＨＰＶ１６Ｅ_７基因片段。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与ｐＵＣ１８载体连接，重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的平板上直接筛选，斑点杂交，ＰＣＲ扩增鉴定和酶切分析证明得到了含ＨＰＶ１６Ｅ_７完整的编码序列的重组克隆。     

口腔鳞癌巨噬细胞侵入与肿瘤血管生成的关系

目的 :比较口腔正常、炎症及鳞癌组织内巨噬细胞和微血管数 ,鳞癌组织侵入的巨噬细胞和血管生成的相互关系。方法 :采用免疫组织化学的方法观察巨噬细胞及微血管。结果 :巨噬细胞记数在鳞癌组织内、正常黏膜及炎症组织内均有差别 (P <0 .0 0 1) ,炎症组织内最多 ,鳞癌次之 ,正常黏膜内最少。微血管记数在鳞癌和炎症组织内较正常黏膜内均有增加 (P <0 .0 0 1) ,但在鳞癌内与炎症组织内两者差别无统计学意义 (P >0 .0 5 )。在鳞癌中随病理分级的增加 ,巨噬细胞的侵入增加 (P <0 .0 5 ) ,微血管记数虽稍有增加但无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ;巨噬细胞记数与微血管记数呈直线相关关系 ,呈正相关 (P <0 .0 1) ,巨噬细胞侵入在肿瘤坏死区域明显增多。结论 :在口腔鳞癌中侵入的巨噬细胞与肿瘤的血管生成有关 ,其在口腔鳞癌中的具体作用仍需进一步研究 ,阻止巨噬细胞侵入可以作为口腔鳞癌治疗的新靶点。     

二步温控法聚合酶链反应检测宫颈癌中HPV-16E_6/E_7相关序列

应用改良的二步温控法 PCR 技术,检测34例人宫颈癌组织 DNA,发现宫颈癌中 HPV-16 E_6/E_7相关序列存在的阳性率为67.6%(23/34)。结果提示:HPV-16可能在宫颈癌的发生发展过程中起重要作用,采用改良 PCR 技术选择性地检测 HPV-16的转化基因(E6、E7)对深入探讨宫颈癌发生的机理、早期发现宫颈癌患者等有重要意义。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

口腔粘膜早期鳞癌36例临床分析

36例口腔粘膜早期鳞癌的临床特征、治疗和预后分析结果表明:好发部位为舌缘、舌腹、颊和软腭等粘膜。损害最常表现为红色或红白间杂外表(占66.7％),很少发生溃疡和外突性生长,自觉症状不明显,容易漏诊。提示口腔粘膜的红白间杂损害可能是早期无症状鳞癌的最早指征,应全切活检以确诊。     

食管癌EC109细胞属人类乳头状瘤病毒18型阳性细胞株

目的：探究食管癌细胞系EC109是否为人类乳头状瘤病毒（HPV）感染。方法：以HeLa细胞为阳性对照，以细胞DNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增HPV基因保守序列GPf／GP6基因片段；PCR扩增I-IPV18 E6和HPV18 E6／E7基因片段：对HPV18 E6／E7PCR扩增产物片段进行测序；采用逆转录（RT）．PCR扩增HPV18E6和研基因片段；利用HPV基因分型芯片对EC109和HeLa细胞进行HPV分型。结果：PCR、RT-PCR和测序结果证明EC109细胞为HPV18阳性细胞；HPV分型芯片结果显示EC109也为HPV18阳性细胞。结论：EC109细胞是属于HPV18亚型感染型细胞。