ER-β基因RNA干扰重组表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对人雌激素受体-β（estrogen receptor-β,ER-β）基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）真核表达载体质粒.方法：根据GeneBank数据库提供的ER-β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列,将此双链DNA 片段克隆至载体pS ilencer3.1-H1-neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒进行序列测定.结果：经测序证明与设计的相同,获得人ER-β基因的siRNA 表达载体质粒.结论：成功构建了针对ER-β基因的RNA干扰重组表达载体,为下一步ER-β基因的RNA 干扰奠定了基础.     

靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选

目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点.方法:首先以EASYMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化1)H5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列.应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析.结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源:PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组.hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜F可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白.hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹榆测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照B-aetin和GAPDH尤明显变化.经β-actin校正,得到各组hTERT蛋向相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%.P＜0.05),其中No.4敲减效能最高.结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5'-GCAAGTTGCAAAGCArrGGAA-3'敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶.     

shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌细胞端粒酶卡侯体蛋白1基因的沉默效应

目的：探讨shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌Cal27细胞系端粒酶新蛋白,即端粒酶卡侯体蛋白1（TCAB1）基因的沉默效应,以期探索肿瘤基因治疗的新途径。方法：根据TCAB1基因,构建慢病毒shTCAB1-A~D,测定病毒滴度;用重组慢病毒体外感染Cal27细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达推断感染效率;半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TCAB1 mRNA水平;Western blot检测TCAB1蛋白质的表达水平;四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测细胞体外增殖能力;Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力改变。结果：经PCR与测序鉴定证实成功构建靶向TCAB1的慢病毒RNAi载体,病毒滴度为1.5×108~3×108 U·mL-1。荧光显微镜观察显示,绝大部分细胞表达绿色荧光。与空白细胞对照组相比,4种不同的shTCAB1-A~D慢病毒感染组TCAB1 mRNA表达下调48.7%~62.0%;蛋白抑制率达45.6%~77.5%,shTCAB1-C组最明显。shTCAB1-C慢病毒能明显抑制Cal27细胞增殖能力,也能降低其侵袭能力,穿过人工基底膜的平均细胞数明显低于空白对照组及非特异性对照组,侵袭抑制率高达67.5%（P〈0.05）。结论：成功构建并包装了端粒酶新蛋白TCAB1靶向的RNAi慢病毒,该病毒可高效感染人口腔鳞状细胞癌细胞,产生特异性的基因沉默效应。     

细胞凋亡抑制基因bcl-2和survivin在血管瘤不同时期的表达

目的:探讨血管瘤自然消退过程与细胞凋亡的关系.方法:收集血管瘤及血管畸形标本63例,均经病理证实;所有患者均未经过激素或其他药物治疗.其中血管瘤44例,按照组织学特征将其分为增殖期23例,退化期21例;血管畸形19例.每例标本采用SABC法免疫组化,检测bcl-2、survivin 2种细胞凋亡抑制基因的蛋白表达,同时以8例正常皮肤组织作为对照.采用SPSS11.0软件包行×列表卡方检验.结果:血管瘤增殖期和退化期的bcl-2表达不同,具有显著性差异(P＜0.01);而survivin的表达无显著性差异(P＞0.05).结论:Bcl-2在血管瘤增殖期血管内皮细胞的高表达与退化期表达有显著性差异.提示该基因可能在血管瘤增殖期抑制内皮细胞凋亡方面发挥作用;而survivin在血管瘤增殖期内皮细胞的高表达,与退化期表达无显著性差异,提示该基因与血管瘤的自然消退关系不大.     

两种人源性doc1基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的:构建p12蛋白真核表达重组载体,为基因治疗口腔癌提供基础研究。方法:反转录-聚合酶链式反应克隆出doc1基因ORF读框,两端连入酶切位点,导入真核表达载体pT7-FLAG-4及pEGFP-N1。结果:重组子pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1经限制性酶切分析,PCR鉴定和序列测定为正确重组质粒。结论:成功构建p12蛋白真核表达重组质粒pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1,为今后瞬时和稳定转染细胞提供基础。     

采用RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰（RNAi）技术抑制口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3细胞凋亡抑制因子survivin基因的表达,促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA）,转染对数生长期的HSC-3细胞。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达,MTT法测定细胞活性,tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡,并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组;MTT法测定细胞活性,阴性对照组和空白对照组没有明显差别,但siRNA组的细胞活性明显下降;tunnel分析显示,转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组;流式细胞术分析,转染siRNA组的凋亡率（24.99％±1.33％）明显高于阴性对照组（1.24％±0.13％）和空白对照组（0.10％±0.02％）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡,survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。     

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的：研究MMP-2存成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法：培养成釉细胞瘤细胞，应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达；体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体，将siRNA质粘表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞，激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率，RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2 mRNA的改变，明胶酶谱法检测MMP-2的变化．应用SPSSI 1．0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果：成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达．siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染半为41.8％；转染后，成釉细胞瘤细胞的MMP-2 mRNA表达水平显著降低，酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少，P〈0．05结论：体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞，并导致MMP-2基因沉默。     

稳定表达cbfal的人牙乳头细胞模型的建立和鉴定

目的：建立能稳定表达核心结合因子a1(cbfal)的人牙乳头细胞模型。方法：体外培养人牙乳头细胞，脂质体法转染重组质粒，G418筛选抗性克隆，并从基因(原位杂交和RT-PCR)和蛋白水平(免疫组化和western blot)进行鉴定。结果：共获得三个G418抗性克隆，其中PC-3克隆能够稳定表达cbfal基因和蛋白。结论：成功建立了稳定表达核心结合因子a1的人牙乳头细胞模型PC-3。     

短发夹状RNA沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的 探讨H-ras基因对涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)生物学特性的影响以及作为SACC基因治疗靶点的可行性.方法 构建H-ras靶向H-ras-shRNA质粒及阴性对照HK-shRNA质粒,经脂质体介导转染SACC-M细胞,G418筛选建立稳定转染细胞株,将细胞分为H-ras-shRNA转染组、HK-shRNA转染组及未转染细胞组.绘制细胞生长曲线检测细胞体外增殖能力;反转录聚合酶链法分析各组细胞中H-ras基因mRNA表达变化;荧光蛋白定量分析H-ras蛋白表达水平;流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况;裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力,分析H-ras沉默对细胞增殖及凋亡的影响.结果 成功构建重组质粒并导入SACC-M细胞,建立稳定表达质粒的细胞株.H-ras-shRNA质粒能有效降低SACC-M细胞中H-ras表达,H-ras基因抑制率为61.80%,H-ras蛋白表达抑制率为62.76%.细胞增殖活性明显受抑,G0G1期比例增加;流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率为30.82%,显著高于阴性对照组及空白对照组的4.29%和4.16%.H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.结论 H-ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC-M细胞中H-ras基因及蛋白水平的表达,降低细胞体内外的增殖活性,并能有效诱导细胞凋亡.     

促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础。方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列。用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养,Western blot及SABC-FITC分析鉴定其表达。瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响。结果:RT-PCR扩增出长500bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异。结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制。     

mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3 .1/V5 HisB融合的高效真核表达载体 ,为研究mcpr1基因的功能奠定基础。方法 :根据mcpr1基因的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过PCR方法 ,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T easy/mcpr1中 ,扩增出该基因外显子片段 ,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3 .1/V5 HisB中。对该重组体进行PCR和酶切鉴定 ,以及测序验证。结果 :以重组体为模板扩增出40 0bp左右的特异性基因片段 ,与mcpr1基因片段大小一致 ,酶切鉴定也显示有 40 0bp左右的基因片断。测序结果显示与已知基因序列一致。结论 :成功构建mcpr1基因的真核表达载体 ,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础。     

癌胚抗原基因真核表达载体的构建

目的：克隆人癌胚抗原（CEA）基因cDNA,构建pcDNA3．1-CEA真核表达载体。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术,从人结肠癌细胞组织克隆出CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcD—NA3．1真核表达载体上,构建成pcDNA3．1-CEA重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增,发现2.1kb的目的基因条带、双酶切电泳分析可见2．1kb的目的基因条带和5．4kb的载体条带、单酶切电泳分析可见0．9kb的条带和6．6kb的条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同。结论：本实验成功地克隆了CEA基因并构建了其真核表达质粒,为进一步研究CEA真核表达载体抗肿瘤的实验打下基础。     

BimS真核质粒过表达载体构建及诱导ACC-2细胞凋亡作用

目的 构建BimS真核质粒过表达载体及鉴定并转染ACC-2细胞,观察其在细胞中上调BimS蛋白表达及促凋亡作用.方法 根据人BimS基因设计引物,扩增目的基因片段,挑选阳性克隆,分别采用PCR扩增电泳和DNA测序鉴定.分为对照组和实验组将构建的质粒表达载体转染ACC-2细胞,通过定量PCR和Western biot检测其基因和蛋白相对表达水平,检测细胞凋亡率和超微结构的变化.结果 实验组细胞凋亡明显,凋亡率为(29.6±0.3)％;对照组细胞凋亡率仅为(0.83±0.2)％,实验组与对照组细胞凋亡率比较具有统计学差异(Pp＜0.05).电镜下实验组细胞呈典型的细胞凋亡形态学改变,对照组细胞形态未发生变化.结论 BimS真核质粒过表达载体构建成功,并能显著上调ACC-2细胞中BimS mRNA、蛋白表达及诱导细胞凋亡.     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2。方法:采用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因,连接T载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接,并进行酶切鉴定,最后将pIRES2-EGFP-hBMP2转染入HEK293细胞中,利用荧光显微镜和Western blot进行表达鉴定。结果:成功克隆了人BMP2基因,酶切鉴定和测序均正确,构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2能够正确表达hBMP2蛋白。结论:构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,为研究该基因的功能奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白- 2（hBMP2）基因片段,构建pcDNA3.1- hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白- 2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1- hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2- cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。     

纤维粘连蛋白片段真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA的构建

目的构建纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）基因的EDA外显子的真核表达载体，以研究EDA对涎腺腺样囊性癌（slivary adenoid cystic carcinoma，SACC）生物学行为的影响。方法以RT-PCR技术从口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma）细胞株KB中扩增出外显子EDA，克隆人pcDNA3．1（＋）真核表达载体，用PCR和限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。结果PCR、酶切、DNA测序鉴定证明成功构建了pcDNA3．1（＋）-EDA真核表达载体，DNA测序显示重组质粒含有与EDA片段基因序列完全相等的基因。结论成功构建了纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）基因的EDA外显子的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。     

少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因突变分析及其真核表达载体的构建

目的克隆少汗型外胚层发育不良症（HED）eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型（M）和野生型（W）的真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的引物, 从HED患者和正常人外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RTPCR法克隆eda-A1（M/W）基因cDNA序列;并运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1（-）载体和eda-A1基因片段,将eda-A1 （M/W） 插入到pcDNA3.1 （-） 载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1 （-）-eda-A1-M和pcDNA3.1（-）-eda-A1-W。结果成功克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因,并发现未见报道过的907位A→C错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸;经PCR法、重组载体双酶切法、DNA测序验证,成功构建了pcDNA3.1（-）-eda-A1-W/M的真核表达载体。结论成功构建少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因（突变型和野生型）真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步研究该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。     

舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株醛脱氢酶高表达亚群细胞生物学特性的研究

目的检测醛脱氢酶（ALDH）在舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中的表达,研究ALDH高表达（ALDHhig）亚群细胞的生物学特性。方法采用流式细胞仪检测Tca8113细胞株中ALDH的表达;分选ALDHhig与ALDHlow亚群细胞,体外培养观察其增殖、分化及在无血清培养基中的成球能力;利用抑制消减杂交（SSH）技术筛选ADLHhig亚群细胞高表达基因。结果舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中仅有1.3%的细胞高表达ADLH;分选出的ADLHhig肿瘤细胞增殖能力高于ALDHlow细胞和未分选的肿瘤细胞;随着培养时间的延长,体外培养的ALDHhig细胞比例逐渐下降至分选前水平;ALDHhig亚群细胞能够在无血清培养基中悬浮生长形成肿瘤球,且高表达干细胞相关基因。结论舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中有一小群细胞高表达ALDH,具有干细胞的生物学特性;ALDH可能是舌鳞状细胞癌干细胞的标志物之一。     

ADAM28真核表达质粒的构建及转染人牙囊细胞后的表达分析

目的:构建金属蛋白酶解离素28(ADAM28)真核表达质粒,转染人牙囊细胞(HDFC)后检测ADAM28在HDFC中的表达分布。方法:采用基因重组技术构建ADAM28真核表达质粒,通过细胞培养、脂质体Lipofectamine2000介导转染HDFC后,应用免疫荧光、RT-PCR及Western印迹检测ADAM28在HDFC中的表达。结果:成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDFC72h后,检测证实真核质粒转染组的HDFC表达ADAM28蛋白,而2个对照组均无表达。结论:ADAM28在HDFC内能被正确翻译和表达,为进一步探讨其在牙源性细胞中的生物学功能奠定了基础。