VEGFR-3siRNA对人结肠癌细胞生长和侵袭力的影响

目的 探讨不同浓度血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人结肠癌细胞生长和侵袭力的影响.方法 设计合成VEGFR-3siRNA,以不同剂量转染到人结肠癌细胞株(human colon adenocarcinoma cell line,LoVo)细胞中,采用四甲基偶氮唑蓝显色法[3-(4,5-dimethl-2 thiahiazoyi)-3,5-di-phenyl-tetrazolium bromide,MTT]观察细胞生长变化,应用半定量逆转录-聚合酶链反应、Western-blot检测转染前后VEGFR-3 mRNA和VEGFR-3蛋白表达的变化,基质-黏附实验检测细胞转染后黏附能力,体外侵袭试验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变.结果 VEGFR-3 siRNA引起LoVo细胞生长抑制,在一定范围内呈浓度、时间依赖性;转染siRNA后VEGFR-3 mRNA和VEGFR-3蛋白表达下降;转染siRNA 72 h后LoVo细胞的黏附能力显著下降,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);VEGFR-3 siRNA使LoVo细胞侵袭能力明显下降,LoVo细胞穿膜细胞数明显低于空白对照组、非特异性对照组(P＜0.05).结论 VEGFR-3siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,下调VEGFR-3基因的表达可以抑制细胞增殖,使LoVo细胞黏附力和侵袭能力明显下降.     

靶向Survivin的siRNA联合表阿霉素对乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响

目的采用RNA干扰技术阻断Survivin基因的表达,观察其诱导乳腺癌细胞凋亡及对表阿霉素的化疗增敏作用。方法构建靶向Survivin的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,采用lipofectamine^TM2000转染乳腺癌细胞MCF-7,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后MCF-7细胞Survivin基因表达的变化;采用TUNEL法检测其诱导MCF-7细胞凋亡及对表阿霉素的化疗增敏作用。结果靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制MCF-7细胞Survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为64．91％;在蛋白质水平其表达抑制率为79．72％;转染靶向Survivin的siRNA真核表达载体48h后可以诱导8．75％的细胞凋亡;阻断Survivin基因的表达。可以显著提高MCF-7细胞对表阿霉素的敏感性,靶向Survivin的siRNA联合表阿霉素可以诱导24.21％的细胞凋亡。结论本研究所构建的靶向Survivin的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断Survivin基因的表达,阻断Survivin基因的表达可以诱导一定程度的MCF-7细胞自发凋亡,并显著增强其对表阿霉素的敏感性。     

载体介导HER-2 RNA干扰治疗乳腺癌研究

目的 探讨载体介导HER-2RNA干扰治疗HER-2阳性乳腺癌的可行性。方法 构建能够产生HER-2 siRNA的质粒载体,利用载体转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR-3,利用RT-PCR与Western blot检测HER-2 mRNA与蛋白表达情况,同时观察转染后SKBR-3细胞凋亡及生长情况。结果 SKBR-3细胞HER-2受到载体介导的RNA干扰后．HER-2 mRNA及蛋白表达出现明显下调,细胞凋亡增加,肿瘤细胞生长受到抑制。结论 乳腺癌HER-2是理想的RNA干扰治疗靶点,靶向HER-2的RNA干扰可以诱导肿瘤凋亡,抑制肿瘤生长。     

靶向survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 采用RNA干扰技术（siRNA）阻断survivin基因的表达,观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。方法 构建靶向survivin的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine^TM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞survivin基因表达的变化;采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用：采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞survivin基因表达,在mRNA水平其表达抑制率为81．25％,在蛋白质水平其表达抑制率为74．24％。转染靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖,细胞接种24、48h后其增殖抑制率分别为28．00％和33.38％：转染后24、48h可以诱导8．46％、7．53％的细胞凋亡。结论 所构建的靶向survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞survivin基因表达。阻断survivin基因表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡,靶向survivin的siRNA在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。     

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

目的构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack,将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确,扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。     

RNAi抑制NEK293细胞TGF-β1表达的研究

目的:探讨针对转化生长因子β1(TGF-β1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGF-β1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGF-β1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RT-PCR和WesternBlot分别检测TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果: siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGF-β1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGF-β1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。     

短发夹RNA靶向抑制EGFR基因对人卵巢癌Skov-3细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对卵巢癌细胞表皮生长因子受体(EFR)基因表达的影响及其效应.方法 体外合成EFR的DNA模板序列和pSilencer 2.1-U6neo质粒构建编码shRNA的表达载体,应用脂质体Lipofectamine 2000将其转染到人卵巢癌Sov-3细胞,采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学技术检测转染前后Sov-3细胞EFR基因的变化;采用AnnexinV/PI双染色标记的流式细胞仪检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果 成功构建pSilencer-EFR短发卡状siRNA真核表达载体;靶向EFR的序列特异性的siRNA可以有效抑制Sov-3细胞EFR基因的表达;流式细胞分析显示,Sov-3细胞凋亡率明显增加,细胞周期出现明显的0/1期阻滞.结论 RNAi沉默EFR表达可以诱导卵巢癌Sov-3细胞凋亡,并使卵巢癌Sov-3细胞停滞在0/1期,RNAi可作为研究卵巢癌发生发展机制和基因治疗的有效工具.     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

siRNA沉默livin基因对食管癌细胞生长与凋亡的影响

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默livin基因在食管癌细胞中的表达情况,探讨livin基因对食管癌细胞生长、凋亡的影响。方法自行设计两条针对livin基因的siRNA：livin—sh-1,livin—sh-2,构建相应的表达载体分别转染至对数生长期的食管癌,经G418筛选后采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、MTT、TUNEL分别比较检测转染前后食管癌细胞livin基因的表达。结果siRNA对照组与空siRNA载体组的livinw／β mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）;但转染siRNA组Livinl／2mRNA表达显著降低,明显低于siRNA对照组和空siRNA载体组（P〈0．05）。细胞生长曲线测定经F检验三组间差异无统计学意义。转染siRNA载体沉默livina／β表达,细胞凋亡率显著增加。结论siRNA沉默livin基因能抑制食管癌细胞的生长,促进食管癌细胞的凋亡,livin基因有可能成为食管癌治疗的新靶点。     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响

目的:探讨沉默蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响。方法:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默PTP1B的表达(shRNA-PTP1B),采用逆转录聚合酶链反应和Western Blot分别在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。CCK-8被用于检测沉默PTP1B表达对肿瘤细胞增殖的影响。在体外实验的基础上建立裸鼠模型,建立稳定表达干扰RNA细胞系,观察干扰RNA稳定表达对人结肠癌裸鼠移植成瘤的影响。结果:shRNA-PTP1B有效沉默LoVo细胞PTP1B mRNA及蛋白的表达,成功筛选shRNA-PTP1B稳定表达细胞株LoVo/shRNA细胞。在体外试验中与对照组比较LoVo/shRNA细胞的增殖能力明显下降。LoVo/shRNA细胞裸鼠移植成瘤体积,明显减小(P均<0.05)。结论:shRNA-PTP1B可以沉默人结肠癌PTP1B基因的表达,显著抑制LoVo细胞的增殖,降低LoVo细胞的成瘤能力。     

RNA干扰沉默中期因子基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰(RNA interference)沉默中期因子(midkine,MK)基因表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据中期因子基因mRNA序列特点,设计合成中期因子基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肝癌SMMC 7721细胞后,分别以实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中期因子表达情况,分别通过检测caspase-3活性和琼脂糖凝胶电泳方法了解肝癌细胞凋亡,以软琼脂集落培养试验检测对各组细胞增殖的影响.结果:中期因子siRNA可有效抑制肝癌细胞中期因子 mRNA和蛋白水平.转染组肝癌细胞caspase-3活性增高,呈浓度和时间依赖性;转染组出现明显的DNA条带.中期因子转染组细胞增殖受到明显抑制,且呈浓度依赖性.结论:采用RNA干扰沉默肝癌细胞中期因子基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导凋亡.     

RNA干扰介导的人肺腺癌A549细胞FasL基因沉默及意义

目的构建针对肿瘤凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,研究RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞FasLmRNA表达的抑制作用,探索Fas／FasI途径在肺癌转移中的作用机制。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasLmRNA为靶基因,合成2对编码短发夹结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达质粒pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞FasL mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样FasLsiRNA真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞后,FasLmRNA的表达水平显著下降。结论成功构建的FasL基因siRNA真核表达载体pSi2．0-FasL能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasLmRNA的表达。     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。     

Induction of apoptosis of human colon cancer cells by siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene

This study constructed siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene and observe the apoptosis induction effect of it in human colon cancer cells, siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cells. The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR, Western blot, MTT reduction assay and flow cytometry. It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed successfully. Inhibition rate of survivin siRNA at mRNA and protein levels was 36.33% and 44.65% respectively. Growth of cancer cells was inhibited and the apoptosis rate was （17.24±2.13）%. The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene has been constructed successfully. It not only can inhibit the expression of survivin gene, but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.