RNA干扰对肝癌细胞株SMMC7721中STAT3基因表达的抑制作用

目的:研究小片段干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞系SMMC7721的化疗敏感性.方法:根据信号转录及转录活化因子3(STAT3)基因设计siRNA序列,通过经脂质体LipofectamineTM2000以siRNA转染SMMC7721细胞.用实时定量PCR检测SMMC7721细胞中STAT3基因表达的抑制.将细胞以10 μmol/L 5-氟脲嘧啶(5-Fu)作用后,用MTT比色法检测细胞生长的抑制率.结果:成功地构建针对STAT3基因的siRNA表达载体.实时定量PCR检测结果显示,SMMC7721细胞经特异性siRNA转染后,STAT3基因的表达受到抑制.RNA干扰(RNAi)能特异、有效地抑制SMMC7721细胞中STAT3基因的表达.MTT比色法检测结果显示,经siRNA作用后SMMC7721细胞抑制率明显增加.结论:设计合成的siRNA表达载体能有效抑制STAT3基因在肝癌细胞系SMMC7721中表达,增强其对化疗药物5-FU的敏感性,为肿瘤的生物学治疗提供了实验依据.     

乙型肝炎病毒x基因转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的建立稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。方法首先PCR扩增HBx基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组子,脂质体转染HepG2细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞系,采用流式细胞术、Western blot鉴定HBx蛋白在细胞中的表达。利用基因芯片技术分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化。结果经HindⅢ和XbaⅠ内切酶酶切和测序鉴定表明成功构建了HBx基因真核表达载体,流式细胞术、Western blot均证实HBx蛋白在HepG2细胞高效表达,基因芯片结果显示在检测的35 000个基因中有98个基因转录显著上调,24个基因转录显著下调。结论成功构建了稳定、高效表达HBx的HepG2细胞,HBx转染HepG2细胞可导致部分基因显著差异表达,差异表达的基因可能参与了肝癌的发生发展。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

hFXYD6真核表达载体构建及对人肝癌细胞系SMMC7721细胞的生物学作用的影响

目的构建人肿瘤相关蛋白FXYD6真核表达载体pc DNA3.1-h FXYD6,研究其对人肝癌细胞系SMMC7721细胞增殖与侵袭的影响。方法扩增h FXYD6 c DNA,将其插入克隆质粒载体p MD18 T Simple,将限制性内切酶酶切后的目的片段插入以限制性内切酶切后的表达质粒载体pc DNATM 3.1/myc-His(-)B中,经聚合酶链反应(PCR)电泳和测序证实后转染至人肝癌细胞系SMMC7721细胞中,同时设pc DNA3.1空载体转染组和pc DNA3.1-h FXYD6载体转染组,比较两组细胞的增殖与侵袭情况。结果成功构建了pc DNA3.1-h FXYD6真核表达载体。转染真核质粒pc DNA3.1-h FXYD6的SMMC7721细胞,经培养48 h,电泳图显示用h FXYD6单克隆抗体识别的特异性蛋白条带。pc DNA3.1-h FXYD6表达载体组细胞较pc DNA3.1空载体转染组细胞增殖速度明显增快。pc DNA3.1空载体转染组、pc DNA3.1-h FXYD6表达载体组细胞穿透Boyden趋化小室滤膜的细胞数分别为(109.9±7.8)个、(167.6±9.3)个,两组差异有显著统计学意义(P0.001)。结论成功构建的pc DNA3.1-h FXYD6真核质粒能在肝癌细胞系SMMC7721细胞中表达目的蛋白,h FXYD6可促进肝癌细胞增殖与侵袭,这为研究h FXYD6的具体作用机制奠定了基础。     

泛素偶联酶UBE2C／UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C／UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T／UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGIZP—N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10和空载体pEGFP—N1利用脂质体Lip2000^TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg／mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP—N1和SMMC7721-pEGFP-N1／UbcH10,阳性转化率达到94％以上。结论人泛素偶联酶UBE2C／UbcH10稳定高表达肝癌细胞株的建立,为该蛋白在肝癌发生发展过程中的具体作用机制的研究奠定了基础。     

创伤弧菌溶细胞素vvhA基因在大肠杆菌中的表达及其对应激因子的调控

目的 用大肠杆菌表达系统表达创伤弧菌溶细胞素,对其溶血活性进行评价.并观察其作用肝癌细胞SMMC7721后,调控肝癌细胞SMMC7721应激因子基因表达情况.方法 构建pET28a(+)-whA表达载体,对包涵体进行三步洗涤后,用金属亲和层析(6×His Tag)纯化重组创伤弧菌溶细胞素(rVVC),并用溶血试验验证重组蛋白活性.复性重组蛋白作用肝癌细胞SMMC7721后,RT-PCR方法 检验SMMC7721细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、热休克蛋白90(HSP90)基因分泌调节情况.结果 用基因工程的方法 成功获得高表达、高纯度(纯度≥96%)rVVC.兔红细胞溶血试验检测表明,rVVC具有溶血活性,其活性为0.2 μg/HU(溶血单位).RT-PCR结果显示,rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达能力,但具有时间、剂量依赖性.结论 表达、纯化并复性的rVVC能明显诱导肝癌细胞SMMC7721的TNF-α、HSP90 mRNA表达.提示rVVC在组织细胞损伤过程中发挥了应激作用.     

VCC－1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定

目的:构建pcDNA3.1(一)/VCC-1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC-7721中.方法:以SMMC7721细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增VCC-1基因编码区cDNA,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(一)中.重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导人到人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RTPCR及Western blot检测转染前后该细胞株VCC-1基因的表达.结果:pcDNA3.1(一)/VCC-1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR及Westcm blot检测,重组质粒转染株的VCC-1基因的表达水平高于对照组,证实VCC-1基因稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因VCC-1的肝癌细胞SMMC-7721稳定转染株,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础.     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

嘌呤霉素抗性基因捕获载体的构建及在细胞中的功能验证

目的 构建具有嘌呤霉素抗性基因捕获载体,扩大基因捕获载体的应用范围.方法 用经改造的捕获载体(gene trapping vector)稳定转染HepG2.2.15肝癌细胞系,经嘌呤霉素筛选,制作单克隆细胞株.用PCR方法验证该载体的在细胞染色体中的整合,ELISA方法证明捕获载体捕获基因后的细胞的功能改变.结果 嘌呤霉素抗性基因捕获载体整合在HepG2.2.15肝癌细胞的染色体上,并能影响细胞HBsAg和HBeAg的分泌.结论 新构建的嘌呤霉素抗性基因捕获载体能在具有G418抗性的细胞中捕获有意义的目的 基因.     

HBx、MHBs~（t155）真核表达载体构建及在HepG2细胞中的表达

目的建立稳定、高效的HBx、羧基末端截短的中分子表面蛋白（MHBst）体外表达细胞株,以进一步研究HBx、MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及其机理。方法设计特异性引物,采用PCR方法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBx、羧基末端截短至155位氨基酸的中分子表面蛋白（MHBst155）编码基因,并定向插入绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-C1的BglⅡ、KpnⅠ和BglⅡ、BamHⅠ酶切位点,转化宿主菌DH5α,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。采用脂质体介导将空载体、重组质粒分别转染到人肝肿瘤细胞株HepG2中,G418筛选抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR、蛋白印迹检测抗性细胞中HBx、MHBst155的mRNA及蛋白水平。结果经酶切及测序鉴定成功构建了pGFP-HBx、pGFP-MHBst155重组表达载体,将空载体及重组质粒转染HepG2,经G418筛选约20 d获得抗性细胞克隆。将带有绿色荧光的抗性克隆扩大培养并经传代40次,细胞仍表达强的绿色荧光。RT-PCR及蛋白印迹检测表明转染重组体的HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-MHBst155细胞有相应的条带,而空载体、空白对照组未出现条带。结论成功构建了HBx、MHBst155真核重组表达载体pGFP-HBx、pGFP-MHBst155,获得了稳定表达融合蛋白GFP-HBx、GFP-MHBst155的HepG2细胞系,为进一步研究HBx及MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及分子机制构建了良好的平台。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过降低P4启动子甲基化水平上调人IGF-II基因的转录

目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。     

PC-1基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化

目的 通过建立稳定表达外源PC-1基因的小鼠成纤维细胞株,初步探讨PC-1基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法 通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3、1(-)／myc-his-pc-1稳定转染NIH3T3细胞,之后利用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)技术,确定外源PC-1基因在靶细胞染色体上的整合及在转录水平的表达。通过细胞形态学分析、MTT实验、细胞周期分析、软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验,观察PC-1基因表达对NIH3T3生物学特性的影响。结果建立了稳定转染PC-1基因的NIH3T3细胞株。PC-1基因表达的小鼠成纤维细胞NIH3T3生长速度加快,在软琼脂上生长并形成集落,接种裸鼠后可成瘤(6／6)。结论 PC-1基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达

目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体,并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因,SacI/NotI双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中,构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF,并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体(按1∶9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞,用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEFcDNA的细胞克隆。用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验,检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的表达。结果:成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体,共转染后EpoR、HAb18GEF均高效表达于转染的HEK293-16细胞的胞膜上。经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF的稳定株,其表达EpoR的阳性率为99.93%,平均荧光强度(MFI)为1036.39,表达HAb18GEF的阳性率为99.51%,MFI为652.72,且可被Zeocin致死。结论:成功地建立了表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的HEK293-16工程细胞株,为进一步利用哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱(MAPPIT)系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础。     

人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B.方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达.MTT分析基因转染细胞株 L929-huCXCR3B 在Mig( monokine induced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力.结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93％.该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44％、44.01％和24.80％.结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.     

稳定表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1基因的鼻咽癌细胞系的建立

目的:建立稳定表达鼻咽癌(NPC)来源潜伏膜蛋白1(LMP1)的鼻咽癌细胞系。方法:利用基因重组技术构建NPC来源LMP1的一般性真核表达载体及上皮特异性表达载体,并将其转染鼻咽癌细胞系CNE-2,用PCR、RT-PCR及蛋白印迹等检测N-LMP1在CNE-2中的整合和表达。结果:①成功构建了N-LMP1的一般性和上皮特异性表达载体。②N-LMP1基因在CNE-2细胞中获得了正确表达。结论:成功建立了稳定表达NPC来源LMP1的鼻咽癌细胞系,为进一步研究LMP1在鼻咽癌细胞中的作用机制奠定基础。     

稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体GluA1亚基单克隆细胞株的构建

目的 构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体GluA1亚基的细胞株。 方法 PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV.0-绿色荧光蛋白（GFP）,采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定GluA1的表达与功能。 结果 菌落PCR鉴定扩增产物与GluA1分子量（2724 bp）一致,经测序插入慢病毒载体序列与GluA1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,GluA1在过表达GluA1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达。单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面GluA1蛋白表达相对一致。单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达GluA1组可记录5~40 pA电信号。 结论 成功构建了稳定表达AMPA受体GluA1亚基的HEK293T细胞株。