重组人绒毛膜促性腺激素-β亚基的纯化及生物活性测定

目的 构建人绒毛膜促性腺激素（HCGB）原核表达载体PG5-HCGβ，使HCGβ在大肠杆菌中获得高效表达。建立一条简单、快速、高效的纯化复性路线，获得具有生物活性的高纯度rHCGβ。方法以本室克隆的PCRII／HCGB为模板，构建PG5-HCGβ，转化大肠杆菌BL21表达HCGβ。表达蛋白顺次用凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化。结果酶切及序列结果显示，PG5-HCGβ构建正确，HCGβ表达约占菌体总蛋白的20％。经过凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化，获得rHCGβ纯度达95％以上。复性的rHCGβ具有促进小鼠子宫生长的生物学活性。结论构建的PG5-HCGβ表达载体在大肠杆菌中获得高效表达，纯化复性的rHCGβ蛋白具有较高的生物学活性，为今后的rHCGβ生产打下了良好的基础。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化◆

背景:次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21)是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性.目的:构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白.方法:取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly(I:C)刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列.克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21.将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达.CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化.结果与结论:实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白.结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白.     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21）是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly（I：C）刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。     

人β2-微球蛋白基因的克隆与原核中的表达

本研究获取主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子的轻链部分,即β2-微球蛋白（β2m）以制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体.根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从人白细胞中克隆β2m的基因,并构建β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达.结果显示：构建的编码成熟β2m的pET-β2m可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达β2m,表达量占菌体总蛋白的32%,β2m以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以Sephacryl S-200HR（S-200）柱层析纯化,纯度可达95%以上,纯化产物采用稀释法复性.Western blot分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性.结论：获得了高效表达人β2m的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的β2m包涵体纯化、复性方法,为制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体奠定了基础.     

体外重组内皮抑素及其抑制肿瘤血管生成机制探讨

目的克隆及表达中国昆明种小鼠的内皮抑素（endostatin）基因。方法RT-PCR方法扩增鼠内皮抑素基因，构建温敏型表达载体pBV220-endostatin，在大肠杆菌DH5“中诱导表达出鼠内皮抑素蛋白。结果筛选出pBV220-endostatin阳性克隆菌株，诱导表达外源蛋白内皮抑素，纯化复性后具有一定生物学活性。结论克隆小鼠内皮抑素基因，重组内皮抑素在大肠杆菌中高效表达，复性后具有抑制血管生长活性。     

体外表达人重组肝细胞增强因子rhALR的分离纯化

目的：对大肠杆菌表达的人源重组肝细胞生长肽进行分离纯化获得目的蛋白rhALR。方法：其表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在，经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理、使包含体纯度达75％以上，用8mol/L尿素变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性，再经浓缩、透析、离子交换凝胶过滤等系列纯化步骤。结果：纯化后目的蛋白纯度达95％以上。回收率达20％。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34+细胞的扩增作用

背景:Fms 样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力.目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用.方法:克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌 BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白.磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用.结果与结论:成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8 mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础.     

人vW因子A2区基因表达及其生物学活性的研究

血管性血友病因子（vWF）在血管性血友病（vWD）以及血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发病中起着重要的作用,并受血浆vWF裂解蛋白酶（ADAMTS-13）的调节.本研究表达vWF中的A2区蛋白,并研究ADAMTS-13对其裂解活性.首先,应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF-A2区蛋白,经纯化、复性获得重组蛋白（rvWF-A2）,并与正常人以及TYP患者血浆进行反应,分析rvWF-A2蛋白的生物学活性.结果表明：重组表达载体pQE-30-vWFA2在大肠杆菌M15中得到高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的42%,Ni-NTA agrose柱层析纯化后,其纯度为98%,经复性的rvWF-A2可作为ADAMTS-13良好的酶解底物,可被枸橼酸钠抗凝的正常人血浆切割,其切割程度随时间的延长而增加,而EDTA抗凝的正常人血浆以及TTP患者血浆无法切割此蛋白.结论：在大肠杆菌中高效表达的rvWF-A2具有良好的生物学活性,为建立定量测定ADAMTS-13活性的方法奠定了坚实的基础.     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

原核表达载体pGEX-4T-1/Snapin的构建和表达鉴定

目的构建pGEX-4T-1/Snapin原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,以纯化得到Snapin/GST融合蛋白。方法用RT-PCR从小鼠血小板RNA中扩增Snapin基因。将目的片段装入原核表达载体pGEX-4T-1并转化至大肠埃希菌E.coli DH5α中,经过IPTG诱导,SDS-PAGE及凝胶扫描分析目的蛋白的表达水平。结果成功获得小鼠Snapin基因并构建得到重组表达质粒pGEX-4T-1/Snapin。筛选获得pGEX-4T-1/Snapin/E.coli DH5α重组转化菌株,诱导表达得到融合蛋白Snapin/GST。结论成功构建小鼠Snapin原核表达载体,并在E.coli DH5α中高效表达融合蛋白Snapin/GST,为深入研究Snapin蛋白的生物学结构和功能奠定基础。