人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

表达BG4蛋白对人胃癌AGS细胞凋亡和端粒酶逆转录酶表达的影响

目的:构建G-四链体抗体BG4基因的真核表达载体p EGFP-N1-BG4,探讨转染该真核表达载体致BG4蛋白过表达对人胃癌细胞株AGS凋亡和端粒酶逆转录酶表达的影响。方法:以BG4基因原核表达载体p SANG10-BG4为模板,PCR扩增出含有BG4基因的目的片段,经TA克隆与p MD18-T载体连接,测序正确后,经Sac I和Pst I双酶切,与真核表达载体p EGFP-N1连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,并进行酶切分析和序列测定,Western blot鉴定BG4蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期;DAPI法及HE染色检测各组细胞凋亡;q PCR和Western blot检测空白对照组、p EGFP-N1组和p EGFP-N1-BG4组端粒酶逆转录酶mRNA和蛋白表达的变化。结果:酶切分析显示,目的基因条带与预期结果相符,DNA测序表明克隆的BG4基因序列正确,Western blot结果表明转染p EGFP-N1-BG4质粒可以成功表达BG4蛋白。转染p EGFP-N1-BG4质粒可抑制细胞进入S期。DAPI法及HE染色显示,p EGFP-N1-BG4组出现明显的新月形核和核固缩的细胞凋亡现象。q PCR和Western blot结果表明,p EGFPN1-BG4组端粒酶逆转录酶表达受到抑制。结论:用p EGFP-N1-BG4真核表达载体转染胃癌细胞株AGS可以抑制该细胞端粒酶逆转录酶表达,诱导细胞凋亡。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的Id2真核表达载体构建

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体，为骨骼肌的组织工程研究提供有效的分子工具。方法：利用RT-PCR的方法扩增出Id2全长cDNA，利用T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接，构建克隆载体，经限制性内切酶EcoR1酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGF-C2真核表达载体，构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2，经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性；并通过细胞转染技术将Id2基因导入L6成肌细胞中。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段，获取了转染外源性Id2基因的L6细胞。结论：我们成功构建了同时携带有G418筛选位点和增强绿色荧光蛋白的Id2真核表达载体？     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体的构建及细胞定位

目的:构建pDsRed1-C3/XAPC7真核表达载体并观察其在786-O、293T和Chang liver细胞株中的定位情况。方法:采用RT-PCR法从HBE135-E6E7细胞株中克隆得到XAPC7cDNA全长序列,将之与pMD18T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中。构建好的pD-sRed1-C3/XAPC7真核表达质粒经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染786-O、293T和Chang liver细胞株中,观察其在真核细胞中的表达。结果:pDsRed1-C3/XAPC7重组子经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功,转染该重组子的细胞株均可见红色荧光蛋白的表达,呈颗粒状分布。XAPC7主要定位于786-O细胞的胞质,胞核罕见,在293T细胞中,胞质和胞核均有分布,且两者间无明显差别,在Changliver细胞中,胞质和胞核亦均有分布,但以胞质为主。结论:成功构建pDsRed1-C3/XAPC7融合基因并进行真核表达,发现XAPC7在不同细胞中的细胞定位具有差异,为下一步研究XAPC7的肿瘤相关功能奠定基础。     

ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响

目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的 克隆人生长抑制因子家族(inhibitor of growth famility member4,ING4)基因,构建其真核表达载体pEGFP-ING4.方法 提取人胎盘总RNA,经RT-PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP-C2载体,构建的真核表达载体pEGFP-ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的 蛋白融合表达.结论 从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究ING4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础.     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.     

泛素偶联酶UBE2C／UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C／UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T／UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGIZP—N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10和空载体pEGFP—N1利用脂质体Lip2000^TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP—N1／UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg／mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP—N1和SMMC7721-pEGFP-N1／UbcH10,阳性转化率达到94％以上。结论人泛素偶联酶UBE2C／UbcH10稳定高表达肝癌细胞株的建立,为该蛋白在肝癌发生发展过程中的具体作用机制的研究奠定了基础。     

慢病毒介导的重组p27^kip1对肾癌恶性表型影响

目的观察LV/p27^kip1慢病毒颗粒感染对肾癌细胞株786-0恶性表型影响及祼鼠皮下移植肿瘤的影响,以明确p27^kip1在肾癌中的生物学特性,期望为肾癌的预后评估及基因治疗策略提供实验依据。方法利用四质粒系统包装并纯化LV/p27^kip1慢病毒颗粒,对786-0细胞进行感染后分别进行Western Blot检测、细胞周期分析、细胞增殖测定、细胞杀伤率测定。选取BALB/C祼鼠,构建皮下移植瘤成功后注射LV/p27^kip1慢病毒,结束治疗后进行组织病理学检查及TUNEL检测。结果通过外源基因的导入,WesternBlot显示p27^kip1蛋白在感染后的786-0细胞中高表达,且跟随MOI值的增高而表达量相应增多;细胞周期分析表明外源性p27^kip1蛋白在786-0细胞高表达可抑制细胞由G1期向S期过渡;细胞增殖曲线提示感染后第72小时起细胞出现显著的数量下降,且随着MOI值的增加提高对细胞增殖的抑制;细胞杀伤性检测表明MOI=2、MOI=4、MOI=8组的LV/p27^kip1感染对细胞有显著杀伤作用,但影响效果无明确的规律;体内实验证实祼鼠皮下肿瘤在病毒的作用下出现了明显的坏死及凋亡。结论增加外源性p27^kip1表达可以阻滞肾癌细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖,诱发凋亡。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

赖型钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法： 以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切，并连接至真核表达质粒pcDNA3上，构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测其表达。结果： PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段，序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3构建成功，RT-PCR检测显示，LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带，而空质粒组无此条带。结论：LipL41的真核重组表达质粒构建成功，并可在哺乳动物细胞中表达。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因,并在真核细胞中获得表达。     

1．3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bew0细胞中的表达

目的构建1．3倍乙型肝炎病毒（HBV）全基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3。并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T—HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1-3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBVDNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1．3倍HBV全基因表达载体．该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg。并可检测到高水平的HBVDNA。结论成功构建了1．3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。     

细胞角蛋白8真核表达载体的构建、表达及生物信息学分析

目的:构建人细胞角蛋白8(CK8)全长CDS序列真核表达载体,并转染人肝癌细胞SMMC7721,为研究CK8的生物学功能提供细胞模型。方法:RT-PCR扩增CK8全长CDS,克隆入pMD18-Tsimplevector质粒,鉴定正确后,亚克隆入质粒pEGFP-C1,构建真核表达载体pEGFP-CK8。脂质体介导转染SMMC7721细胞,荧光显微镜、realtimePCR和Westernblot检测CK8的表达。生物信息学软件分析CK8理化特性、信号肽及功能位点等。结果:PCR、酶切和测序结果均证实重组质粒含有人CK8全长CDS序列,转染实验表明CK8在SMMC7721细胞中发生了高表达。结论:成功地构建了人CK8全长CDS真核表达载体,并使其在SMMC7721细胞中获得高表达,为研究CK8的生物学功能奠定了实验基础。     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-hArgBP2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀的方法纯化hArgBP2蛋白。结果:hArgBP2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体pEGFP-C1中,Western blot检测到了GFP-hArgBP2融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为97 000。GFP-hArgBP2在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hArgBP2蛋白。结论:成功地构建了GFP-hArgBP2真核表达质粒,同时鉴定了GFP-hArgBP2融合蛋白的表达,并纯化hArgBP2蛋白。GFP-hArgBP2蛋白主要定位在细胞质和核周。