非小细胞肺癌中Axin基因启动子区异常高甲基化与临床病理因素的关系

目的体轴抑制因子(Axin)是Wnt信号传导通路的关键抑制因子,其基因启动子区存在CpG岛,本研究的目的是探讨非小细胞肺癌组织中Axin基因启动子区是否存在异常高甲基化,以及高甲基化对Axin转录水平的影响,及其与肺癌患者临床病理因素的关系。方法应用巢式甲基化特异性PCR(Nested MSP)对98例肺癌组织及其配对癌旁正常肺组织中Axin基因启动子区的甲基化状态进行了检测,同时应用RT-PCR方法检测了肺癌组织及其配对癌旁正常肺组织中Axin mRNA的水平,并且通过卡方检验统计Axin基因启动子区高甲基化状态与肺癌患者临床病理因素的关系。结果部分非小细胞肺癌组织中Axin基因启动子区处于高甲基化状态(42/98),而其配对的癌旁正常肺组织中Axin基因处于半甲基化或非甲基化状态(56/98),高甲基化的肺癌组织中Axin mRNA的水平明显低于其配对癌旁正常肺组织及非高甲基化的肺癌组织中Axin mRNA的水平;Axin基因启动子区异常高甲基化与非小细胞肺癌患者的分化程度负向关,与TNM分期及淋巴结转移正相关。结论非小细胞肺癌中Axin基因启动子区高甲基化与Axin的转录水平和非小细胞肺癌的分化程度负相关,与TNM分期及淋巴结转移正相关。     

原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常

为检测胃癌组织中抑癌基因p16,p15及其启动子区甲基化状态和P16、P15蛋白表达情况。选择p16、p15基因及启动子区域，用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）和测序法对100例胃癌患者的癌组织、癌旁正常组织和5例正常组织进行检测，同时用免疫组化法检测了癌组织和正常对照组织的P16和P15的表达。结果发现癌组织p16和p15基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织和正常对照；胃癌组织中，71％的病例P16表达阴性，54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化，无突变和纯合缺失检出；11％的病例P15表达阴性，9％的病例具有p15基因启动子区的高甲基化，p15异常与低分化胃癌有关，p15基因内含子1和外显子1内各发现1例DNA序列改变；癌组织中p16和p15基因启动子区甲基化与其蛋白表达密切相关。结果显示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的关键因素之一，并在胃癌的发生发展中发挥重要作用；p15基因启动子区域高甲基化在胃癌中起一定作用。     

Dact1基因在结直肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的：观测Dact1基因在结直肠癌组织的表达及其启动子甲基化状态,并探讨它们之间的关系及在结直肠癌发生中的作用.方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结直肠癌组织、癌旁组织各50例及正常对照组织20例Dact1基因mRNA的表达情况,甲基化特异性PCR（MSP）检测Dact1基因启动子甲基化状态.结果：结直肠癌组中,9例Dact1基因mRNA失表达（18%）,20例表达低于正常对照组（40%）;癌旁组织组中,1例Dact1基因mRNA失表达（2%）,3例表达低于正常对照组（6%）;正常对照组中,1例Dact1基因mRNA低表达（5%）.Dact1基因在癌组织、癌旁组织、正常对照组织中的甲基化阳性率分别为46%、12%、5%,癌组织组与癌旁组织组及正常对照组阳性率比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）,而癌旁组织组和正常对照组阳性率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.Dact1基因mRNA的失表达（低表达）与其启动子甲基化状态的相关性分析有统计学意义（P＜0.05）.结论：Dact1基因mRNA的失表达（低表达）可能参与了结直肠癌的发生发展,其失表达可能与Dact1启动子区甲基化相关.     

食管鳞癌雌激素受体α基因启动子甲基化异常

【摘要】目的：研究雌激素受体α(ERα)基因及启动子超甲基化与食管鳞癌的关系。方法：用RT-PCR法检测2个食管鳞癌细胞系ERα mRNA表达情况,甲基化特异PCR技术（MSP）检测ERα基因启动子超甲基化,对超甲基化的细胞用脱氧胞苷（5-aza-dc）去甲基化后检测细胞ERα mRNA。MSP检测47份组织ERα基因启动子超甲基化。结果：食管鳞癌细胞系存在 ERα基因启动子甲基化及其引起的ERα mRNA表达缺失。57.4% (27/47)的原发性食管鳞癌细胞有ERα基因启动子区的超甲基化,其中女性患者ERα启动子超甲基化检出率73.7% (14/19),明显高于男性(15/28,53.6%,P<0.05)。结论：ERα基因启动子超甲基化与食管鳞状上皮细胞癌相关。     

肾透明细胞癌患者肾组织干扰素调节因子6基因启动子区甲基化与总生存率的相关性研究

目的探讨干扰素调节因子6(IRF6)基因启动子甲基化在判断肾透明细胞癌(KIRC)患者预后中的价值。方法收集2016年1月至2020年1月在南京医科大学第一附属医院首诊的50例KIRC患者的原发灶组织, 采用免疫组化法检测其IRF6蛋白的表达情况, 并分析IRF6表达水平与患者生存及肿瘤转移的关系。使用生物信息学方法分别比较KIRC和正常肾组织中IRF6的mRNA及蛋白水平差异, 基于大数据库分析癌和癌旁组织中IRF6基因启动子区甲基化率差异;将IRF6基因启动子区甲基化状态与患者总生存率(OS)进行统计分析, 筛选出呈现显著负相关的区域, 利用细胞系体外验证该启动子区甲基化区域与IRF6转录水平的关系。结果 KIRC组织中IRF6 mRNA和蛋白水平均显著低于正常样本(P<0.05), 该现象在死亡或发生肿瘤转移的KIRC患者中较为突出。KIRC组织中IRF6基因启动子区甲基化程度远高于临近正常肾组织, 并且IRF6基因启动子区甲基化与IRF6 mRNA之间存在显著负相关性(R=-0.52)。IRF6基因启动子区域cg12034118和cg16030177的甲基化程度越高, 患...     

食管鳞癌组织中TIG1基因甲基化及其mRNA表达的研究

 目的：探讨他扎罗汀诱导基因1（tazarotene-induced gene-1, TIG1）基因甲基化及表达与食管鳞癌发生、发展的关系。方法：采用甲基化特异性PCR检测43例食管鳞癌组织、20例癌旁组织和15例正常组织中TIG1基因甲基化状态;实时荧光定量PCR法法检测TIG1 mRNA的表达。结果：食管鳞癌组织TIG1基因启动子甲基化率为25.6%（11/43）,癌旁组织5.0%（1/20）,正常组织中未检测到其甲基化,差异有统计学意义（P<0.05）;其甲基化水平与患者性别、年龄、肿瘤生长部位和分化程度无关（P>0.05）,但与患者TNM分期（P<0.01）及淋巴结转移（P<0.05）有关。鳞癌组织TIG1 mRNA显著低于癌旁组织（P<0.05）及正常组织（P<0.01）,甲基化组织TIGI mRNA表达显著低于非甲基化组织（P<0.01）。结论：甲基化可能是食管鳞癌中TIG1基因失活的重要机制,与患者病理分期及淋巴结转移有关。     

食管鳞状细胞癌中p16基因甲基化及其表达

目的：探讨食管鳞状细胞癌p16／INK4基因启动子区高甲基化和p16、cyclinD1蛋白表达的意义。方法：用甲基化特异性PCR（MSP）法检测p16／INK4基因启动子区的高甲基化，用免疫组织化学方法检测p16、cyclind1蛋白的表达。结果：30例食管鳞状细胞癌中7例p16免疫组织化学阳性，15例cyclinD1阳性，组织学和统计学分析显示p16与cyclinD1的表达呈负相关。4例检出p16／INK4基因启动子区高甲基化，但与p16失表达无统计学意义。结论：（1）在食管鳞状细胞癌可检出p16／INK4基因启动子区的高甲基化，而甲基化不是引起p16失表达的主要原因。（2）p16与cyclinD1的表达呈负相关，提示细胞周期调控因子之间可能存在相互影响表达的反馈机制。     

胃癌中p16INK4a基因启动子高甲基化及其蛋白表达

目的探讨胃癌中p16^INK4a基因失活的主要分子机制及其与胃癌发生、发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR技术检测62例胃癌和癌旁组织及10例慢性胃炎黏膜p16^INK4a基因启动子区CpG岛甲基化状态,用免疫组化EnVision两步法检测p16^INK4a蛋白的表达。结果62例胃癌和癌旁组织p16^INK4a基因启动子高甲基化率分别为51．6％（32／62）和19.4％（12／62）,10例正常对照胃黏膜未发现高甲基化,胃癌组织p16^INK4a基因启动子高甲基化率高于癌旁组织和正常对照（P〈0．05）。58.1％（36／62）的胃癌组织p16^INK4a蛋白表达阴性,其中72.2％（26／36）的病例具有p16^INK4a基因启动子的高甲基化,p16^INK4a基因启动子的高甲基化与其蛋白失表达密切相关（P〈0.05）。结论胃癌中p16^INK4a基因启动子的高甲基化是p16^INK4a基因失活的主要机制,并可能是胃癌发生中的早期分子事件。     

乳腺癌中印记基因SLC22A18/TSSC5/BWR1A启动子区甲基化及mRNA表达的研究

目的： 研究印记基因SLC22A18启动子区甲基化对乳腺侵润性导管癌组织中的SLC22A18 mRNA表达的影响，探讨其与临床病理特征之间的关系。方法：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative RT-PCR）方法检测40例乳腺侵润性导管癌及其癌旁组织中SLC22A18 mRNA的表达，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SLC22A18基因启动子区的甲基化状态。检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231后，对SLC22A18基因启动子区DNA甲基化和mRNA表达的影响。结果：SLC22A18在40例乳腺侵润性导管癌中mRNA表达量低于癌旁组织（0.12±0.10 vs 0.69±1.05，P＜0.01）；40例乳腺侵润性导管癌及对应癌旁组织中，SLC22A18启动子区的甲基化发生率分别为75％和37.5%，差异有统计学意义（P＜0.01）；在40例乳腺侵润性导管癌组织中，甲基化组SLC22A18 mRNA表达量低于非甲基化组（0.11±0.08 vs 0.24±0.18，P＜0.01）。5-aza-dc和5-aza-dc/TSA能不同程度逆转乳腺癌细胞株MDA-MB-231中SLC22A18基因的甲基化状态，并上调SLC22A18基因表达。结论：SLC22A18基因甲基化与乳腺癌发生有一定的关联，SLC22A18基因表达下调与其启动子区CpG岛异常甲基化相关。     

肝细胞癌抗原587基因甲基化调节HCA587-TAF9互作介导肝细胞癌的侵袭和迁移

目的：研究肝细胞癌抗原587（HCA587）在肝细胞癌（HCC）组织中的表达和启动子区甲基化状态,探 讨HCA587对肝细胞癌细胞迁移和侵袭的调节机制。方法：纳入肝细胞癌肿瘤组织114 例,分为HCC组和癌旁 非癌组织（NT）组。荧光定量PCR 检测HCA587的mRNA表达量;免疫组织化学和免疫印迹检测HCC组和NT 组组织中HCA587的蛋白表达。基于甲基化敏感酶和甲基化依赖酶酶切,并结合荧光定量PCR 方法分析肝细胞 癌组织中HCA587基因启动子区甲基化状态。构建重组HCA587过表达质粒（pcDNA3.1-HCA587）,培养人肝 细胞癌细胞系BEL-7404,转染pcDNA3.1-HCA587 或者使用甲基化抑制剂5-Azacytidin 处理细胞。细胞分为对照 组、5-Azacytidin 组、pcDNA3.1-HCA587 组和pcDNA3.1-HCA587 空载体（EV） 组。免疫沉淀法分析HCA587 与TATA 盒结合蛋白相关因子9（TAF9）的结合,Transwell 小室检测细胞的迁移和侵袭能力。结果： 与癌旁非 癌组织组比,HCC组的HCA587在mRNA和蛋白水平均上调。免疫组织化学证实HCC组组织中HCA587阳性表 达。HCC组中HCA587的启动子区CpG 岛甲基化水平降低。体外实验结果显示,5-Azacytidin 促进BEL-7404 中 HCA587的表达、HCA587与TAF9的结合、BEL-7404 细胞的迁移和侵袭能力,但抑制HCA587甲基化水平;另外, HCA587过表达增强BEL-7404 细胞的迁移和侵袭能力。结论：HCA587高表达或抑制其启动子区甲基化可以促进 HCA587与TAF9的结合及导致肝细胞癌细胞的迁移和侵袭。     

Promoter hypermethylation and reduced expression of RASSF1A are frequent molecular alterations of endometrial carcinoma.

Alterations in the regulation of the RAS-MAPK pathway are frequent in endometrial carcinoma. RASSF1A is a tumor-suppressor gene that can regulate this pathway negatively. RASSF1A has been found to be inactivated by promoter methylation in some human tumors. The aim of the study was to assess the immunohistochemical expression of RASSF1A in normal endometrium and endometrial carcinoma, and to correlate its expression with K-RAS mutations, presence of microsatellite instability, RASSF1A promoter methylation, and clinicopathological data. RASSF1A immunostaining was evaluated in one tissue microarray constructed from 80 paraffin-embedded samples of normal endometrium, and two tissue microarrays constructed with a total of 157 endometrial carcinomas (one constructed with 95 endometrial carcinomas previously evaluated for K-RAS mutations, and microsatellite instability, and another one containing 62 endometrial carcinomas that were also subjected to RASSF1A promoter methylation analysis). RASSF1A immunostaining was correlated with cell proliferation (Ki67), Cyclin D1 expression and clinicopathological data. Promoter methylation of RASSF1A was assessed by methylation-specific PCR. RASSF1A immunostaining was variable during the menstrual cycle in normal endometrium. RASSF1A expression was significantly reduced in 48% of endometrial carcinomas, particularly in tumors exhibiting microsatellite instability. RASSF1A-promoter methylation was very frequent in endometrial carcinoma (74%), and was frequently associated with reduced expression of RASSF1A. RASSF1A-promoter hypermethylation was common in advanced-stage endometrial carcinoma. The results suggest that reduced expression of RASSF1A may play a role in endometrial carcinogenesis by controlling cell proliferation and apoptosis through the MAPK-signaling pathway.     

RASSF1A and NORE1A methylation and BRAFV600E mutations in thyroid tumors

We analyzed RASSF1A and NORE1A methylation and BRAF mutation in 89 thyroid tumors, 42 non-neoplastic thyroid tissues and three thyroid tumor cell lines using polymerase chain reaction (PCR), methylation-specific PCR, Western blotting and DNA sequencing in order to study thyroid tumor pathogenesis and progression. RASSF1A promoter methylation was present in all three thyroid cell lines and in 27/78 (35%) of benign and malignant thyroid tumors. We showed for the first time that there was generally good agreement between RASSF1A methylation status and RASSF1A protein expression. We also examined for the first time NORE1A promoter region methylation in thyroid cell lines and primary tumors and showed that two of three thyroid cell lines were methylated in the NORE1A promoter region, while all primary thyroid tumors analyzed (n=51) were unmethylated. BRAF mutation was present in 38% of papillary thyroid carcinomas (PTC), including 20% of PTC with a follicular variant pattern and 67% of the tall cell variant of PTC. Hyalinizing trabecular tumors (n=23), which had nuclear features similar to PTC, did not have BRAF mutations, indicating that the presence of BRAF mutations can help to separate these two tumor types. Phospho-MEK expression was increased in the NPA cell line, which had a BRAF mutation, supporting the importance of the BRAF pathway alterations in PTC pathogenesis. These results indicate that RASSF1A epigenetic changes are an early event in thyroid tumor pathogenesis and progression and that NORE1A methylation is uncommon in primary thyroid tumors. BRAF mutation occurs later in thyroid tumor progression and is restricted mainly to PTC and anaplastic thyroid carcinoma.     

Identification of Hypermethylation in Hepatocyte Cell Adhesion Molecule Gene Promoter Region in Bladder Carcinoma

Background: Epigenetic regulation such as aberrant hypermethylation of CpG islands in promoter plays a key role in tumorigenesis. 5-Aza-2''-deoxycytidine (5-aza-CdR) which is a potent inhibitor of DNA methylation can reverse the abnormal hypermethylation of the silenced tumor suppressor genes (TSGs). It has been reported that hepatocyte cell adhesion molecule (hepaCAM) acts as a tumor suppressor gene and expression of its mRNA and protein were down-regulated in bladder cancer. Over-expression of hepaCAM can inhibit cancer growth and arrest renal cancer cells at G0/G1 phase. In this study, we investigated the methylation status of hepaCAM gene, as well as the influence of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM gene in bladder cancer cells. Methods: CpG islands in hepaCAM promoter and methprimers were predicted and designed using bioinformatics program. Methylation status of hepaCAM promoter was evaluated in bladder cancer tissues and two cell lines (T24 and BIU-87) by Methylation-specific PCR; Western blot and Immunofluorescence were used to detect expression of hepaCAM protein after 5-aza-CdR treatment; Flow cytometry assay was performed to determine effectiveness of 5-aza-CdR on cell cycle profile. Results: CpG island in promoter of hepaCAM gene was hyper-methylated both in bladder carcinoma tissues and cell lines (T24 and BIU-87). Otherwise, aberrant methylation of its promoter was associated with its decreased expression. Hypermethylation of hepaCAM gene was reversed and expression of its mRNA and protein were re-activated in two cell lines by DNA methyltransferases inhibitor 5-aza-CdR. Flow cytometry assay demonstrated that 5-aza-CdR can inhibit growth of cancer cells by arresting cancer cells at G0/G1 phase. Conclusion: Abnormal hypermethylation in CpG island of hepaCAM promoter is involved in absence of hepaCAM gene expression when bladder cancer occurs. Re-activation of hepaCAM gene by 5-aza-CdR can inhibit growth of cancer cells and arrest cells at G0/G1 phase.     

非小细胞肺癌患者紧密连接蛋白-1基因启动子甲基化分析及其临床意义

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者中紧密连接蛋白-1(ZO-1)基因甲基化检测的临床意义.方法应用甲基化特异性聚合酶链反应MS-PCR检测101例NSCLC患者癌组织及癌旁组织ZO-1基因启动子甲基化状态,以61例肺部良性病变患者作为对照,并用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测63例甲基...     

髓母细胞瘤与幕上原始神经外胚叶肿瘤中RASSF1A基因的甲基化差异

目的通过研究髓母细胞瘤与幕上原始神经外胚叶肿瘤（SPNET）中RASSF1A基因的甲基化改变,探讨颅内原始神经外胚叶肿瘤（PNET）的不同亚型中该基因的表遗传学差异及其意义。方法收集25例原发髓母细胞瘤,9例原发SPNET,3株髓母细胞瘤细胞系和2株SPNET细胞系。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测RASSF1A基因启动子区的甲基化状态。应用去甲基化试剂5-aza-2’deoxycytidine处理存在基因表达缺失的细胞系,探讨基因表达与甲基化之间的关系。结果100％（25／25）的原发髓母细胞瘤、6／9的原发SPNET及全部PNET细胞系中均检测到RASSFIA基因的甲基化。相反,该基因甲基化在全部正常组织（包括2例小脑,5例大脑）中均未检测到。并且,RASSF1A在SPNET中的甲基化率明显低于髓母细胞瘤（Fisher精确检验,P=0．014）。在经去甲基化试剂处理的PNET细胞中,该基因表达得以恢复,证明甲基化与该基因沉默相关。结论RASSF1A甲基化是肿瘤特异性的,RASSF1A甲基化与PNET的发生有一定关联,不同亚型的PNET之间RASSF1A基因的不同甲基化状态提示髓母细胞瘤和SPNET是表遗传学上存在差异的两类肿瘤。     

乳腺癌发生过程中NOEY2基因启动子区甲基化及mRNA表达

目的 探讨乳腺癌发生过程中抑癌基因NOEY2启动子区甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法 应用甲基化特异性PCR及双亚硫酸钠基因测序技术检测MCF10模型中乳腺增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCFIODCIS．com、浸润癌细胞系MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h及正常乳腺组织中NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ甲基化状态,然后用RT-PCR和实时PCR技术检测上述样品的mRNA表达水平。结果 MCF10模型的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系、浸润癌细胞系均发生该基因启动子区CpG岛Ⅰ高度甲基化;与正常乳腺组织相比,上述细胞系mRNA表达显著减少。结论 NOEY2基因启动子区高度甲基化及相应的mRNA表达减少是乳腺癌发生过程中的早期事件,与乳腺癌发生有关,可能成为早期诊断乳腺癌的潜在分子生物学标记。