金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的 克隆葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrap^TM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白可溶性微针制备及免疫效果研究

目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。     

金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是一组可溶性单链蛋白,是金黄色葡萄球菌分泌的细菌外毒素,在结构和功能上有一定的相似性.经典的SE分为SEA,SEB,SEC,SED,SEE 5型[1],其中SEC又可分为SEC1,SEC2和SEC3 3种亚型.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A（SEA）基因,亚克隆入表达载体pET-28a（＋）,诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a（＋）连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a（＋）-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a（＋）-SEA/BL21在相应分子量（约30000Mr）条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性分析

目的:检测2015年-2021年贵阳市食源性致病菌中的金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性,为有效防控贵阳市金黄色葡萄球菌食物中毒提供基础数据及参考.方法:将2015年-2021年贵阳市收集并分离出的27株金黄色葡萄球菌采用微孔板酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来检测肠毒素,并使用革兰阳性药敏板对27株金黄色葡萄球菌进行22种抗生素耐药检测.结果:本研究发现27株金黄色葡萄球菌中有17株产生肠毒素,其中13株产肠毒素SEA,3株产肠毒素SEB,1株产肠毒素SED;药物敏感实验发现,24株金黄色葡萄球菌产生了耐药性并且为多重耐药,占总菌株的85.2％,青霉素与氨苄西林的耐药率最高,占85.2％.不产肠毒素的金黄色葡萄球菌株对四环素的耐药率高于产肠毒素的金黄色葡萄球菌(P<0.01),而不产肠毒素的菌株及产肠毒素的菌株对其余抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:2015年-2021年贵阳市爆发的食源性疾病与食品安全风险监测中所分离出的金黄色葡萄球菌只有部分产生肠毒素,但是金黄色葡萄球菌的耐药率较高,多重耐药现象严重,耐药性与肠毒素的关系需进一步探究.     

抗D型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其初步应用

应用小鼠杂交瘤技术获得了５株分泌抗Ｄ型葡萄球菌肠毒素（ＳＥＤ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞（ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＢ１１、４Ｄ３和４Ｄ５）。其中４Ｄ３为ＩｇＭ（λ），其余为ＩｇＧ１（ｋ）。这组ＭｃＡｂ除ＤＣ３外，其它４株ＭｃＡｂ识别的抗原构象表位相同，其相亲和力依次为４Ｄ５〉ＤＣ３〉ＤＣ４〉４Ｄ３〉ＤＢ１１。利用抗ＳＥＤ多克隆抗体ＨＲＰ标记的ＤＣ３和４Ｄ３（针对不同表位）混合ＭｃＡｂ建立了夹心ＥＬＩＳＡ法，并     

金黄色葡萄球菌及其肠毒素B对慢性实验性哮喘小鼠的影响

目的探索金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）对实验性支气管哮喘小鼠肺组织Th0细胞分化的在体调节和对气道炎症的作用。方法32只15～17dBALB／c小鼠，随机分为4组：对照组、模型组、金黄色葡萄球菌组、金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）组。用卵蛋白（OVA）致敏和激发建立小鼠慢性哮喘模型，在致敏前14d对幼年鼠做金黄色葡萄球菌或SEB预防性腹腔注射。观察记录小鼠的耗氧量、肺组织切片、支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞及相关细胞因子等的改变。结果金黄色葡萄球菌组与模型组相比，肺组织病理切片结构紊乱减轻、炎症细胞明显减少，小鼠耗氧量降低（5．24±0．12vs5．59±0．18），BALF中IL-4水平明显下降（44．94±4．51vs29．37±4．17），IFN-γ水平明显增加（19．61±3．83vs29．33±4．04），SEB组也有上述作用（耗氧量：5．09±0.20；细胞介素4：36．68±5．10；γ干扰素：24．27±3．46）。结论金黄色葡萄球菌能明显减轻实验性哮喘的气道炎症，纠正哮喘小鼠肺组织中Th1／Th2细胞因子的失衡，其作用可能是通过其分泌的SEB。     

抗D型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其初步应用

应用小鼠杂交瘤技术获得５株分泌抗Ｄ型葡萄球菌肠毒素（ＳＥＤ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞（ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＢ１１、４Ｄ３和４Ｄ５）。其中４Ｄ３为ＩｇＭ（λ），其余为ＩｇＧ１（ｋ）。这组ＭｃＡｂ除ＤＣ３外，其它４株ＭｃＡｂ识别的抗原构象表位相同，其相对亲和力依次为４Ｄ５＞ＤＣ３＞ＤＣ４＞４Ｄ３＞ＤＢｌｌ。利用抗ＳＥＤ多克隆抗体与ＨＲＰ标记的ＤＣ３和４Ｄ３（针对不同表位）混合ＭｃＡｂ建立了夹心ＥＬＩＳＡ法，并以该法检测了自临床标本中分离的８０林金葡萄菌所产生的ＳＥＤ，其产毒率为４１．３％。     

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的 构建稳定的SED原核表达系统。方法 采用PCR技术扩增葡萄球菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS－PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS－PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果 成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量约为28000u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高（＞95％）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论 本研究为SED免疫识别研究奠定了实验基础。     

Possible influences of Staphylococcus aureus on atopic dermatitis — the colonizing features and the effects of staphylococcal enterotoxins

BACKGROUND: Heavy colonization of atopic dermatitis (AD) with Staphylococcus aureus is well documented. This phenomenon suggests that S. aureus in AD lesions influences the disease processes of AD. OBJECTIVE: We describe the importance of the presence of S. aureus and staphylococcal enterotoxins A and B (SEA, SEB) in AD lesions. METHODS: We investigated the colonizing features of S. aureus in AD lesions using electron microscopy, the distribution of SEB in the eczematous skin of AD using immunofluorescence, the effects of SEA and SEB on normal human epidermal keratinocytes in organ culture, and the presence of specific IgE antibodies to SEA and/or SEB in serum of AD patients by enzyme immunoassay. RESULTS: S. aureus in AD lesions colonized on and in the horny layers of the eczematous skin. SEB produced by S. aureus was distributed mainly on the dermal-infiltrated cells, especially on eosinophils. SEA and SEB stimulated expression of ICAM-1 and HLA-DR in normal human keratinocytes. More than half of the AD patients in the present study had specific IgE antibodies to SEA and/or SEB in their serum. CONCLUSION: S. aureus and SEs have important roles in the exacerbation and prolongation of AD.     

Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from a fatal case of necrotizing fasciitis in an extremely low-birth-weight infant

Necrotizing fasciitis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an uncommon but life-threatening infection, and has mainly been reported as occurring in adults and the elderly. Recently, infant cases involving Panton–Valentine leukocidin (PVL)-positive community-acquired MRSA have been noted. Here, a case of fatal necrotizing fasciitis with sepsis and disseminated intravascular coagulation in an extremely low-birthweight infant is described. The causative agent was the hospital-acquired MRSA New York/Japan clone carrying the spa variant gene and nine staphylococcal enterotoxin (SE) genes. These data suggest that a high-level combination of SEs and other virulence factors, but not PVL, could contribute to the pathogenesis of fatal necrotizing fasciitis.     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的 克隆人生长抑制因子家族(inhibitor of growth famility member4,ING4)基因,构建其真核表达载体pEGFP-ING4.方法 提取人胎盘总RNA,经RT-PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP-C2载体,构建的真核表达载体pEGFP-ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的 蛋白融合表达.结论 从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究ING4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础.     

GFP和RFP报道基因在人体不同细胞中转导率的比较研究

目的 比较慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）报道基因在人体不同细胞中的转导率,为再生医学和组织工程学研究中报道基因的选择提供依据.方法 将构建的GFP和RFP慢病毒载体分别转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）、人脐静脉内皮细胞株（Eahy926）和人肺泡上皮细胞株（A549）.4d后,用流式细胞仪检测GFP和RFP的转导率,并利用激光共聚焦显微镜观察GFP和RFP的表达特征.结果 GFP和RFP在hMSC、Eahy926和A549三种细胞间的转导率均有显著性差异（P﹤0.01）;在hMSC或Eahy926或A549的同种细胞中GFP和RFP的转导率也有显著性差异（P﹤0.01）;RFP在部分Eahy926和A549细胞局部高表达.结论 慢病毒载体介导的GFP和RFP报道基因在人体不同细胞中的转导率明显不同.