金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A（SEA）基因,亚克隆入表达载体pET-28a（＋）,诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a（＋）连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a（＋）-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a（＋）-SEA/BL21在相应分子量（约30000Mr）条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ldh-1基因的序列分析及原核表达

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株携带的ldh-1基因进行克隆、表达,为L．乳酸脱氢酶（L．LDH）功能研究奠定基础。方法根据金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因序列,设计一对特异性引物,以MRSA临床分离株（菌株号：1758）DNA为模板PCR扩增ldh-1,纯化DNA进行BamHI、Xhol I双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET一28a（＋）连接,转化大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用1PTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。诱导表达后的重组菌经超声破碎离心后,使用Ni2＋_NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果成功构建重组表达质粒pET．28a—ldhl,基因测序结果显示,扩增的ldhl基因全长956bp,与金黄色葡萄球菌Mu50株ldhl基因的序列同源性为100％。IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳在39-103Mr处见目的条带,Westernblot验证了重组蛋白L．LDH的表达。该蛋白呈可溶性表达,纯化后获得0．5g／L的重组蛋白。结论在MRSA（菌株号：1758）1~床分离株中成功克隆及表达了ldh．1基因,获得了纯化的重组蛋白．为进一步进行L．LDH的功能研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的 克隆葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrap^TM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。     

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的 构建稳定的SED原核表达系统。方法 采用PCR技术扩增葡萄球菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS－PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS－PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果 成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量约为28000u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高（＞95％）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论 本研究为SED免疫识别研究奠定了实验基础。     

登革病毒Ⅱ型E基因片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

目的分析登革病毒Ⅱ型（DEN2）重组包膜蛋白的免疫原性，为登革Ⅱ型亚单位疫苗的研制奠定基础。方法扩增DEN2E基因片段（254—395AA），与表达载体pET-30a连接，构建重组表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白。重组蛋白经高效液相色谱（HPLC）柱纯化后，进行阻断DEN2感染C6／36细胞试验，同时用重组蛋白免疫小鼠，采用中和实验法测定血清中和抗体效价。结果该基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，重组蛋白可被抗DEN2多克隆抗体识别，纯化后的重组蛋白能有效地抑制DEN2感染C6／36细胞，经重组蛋白免疫的小鼠可产生中和抗体。结论表达的DEN2重组包膜蛋白具有良好的免疫原性，能诱导中和抗体的产生。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素基因B的原核表达

目的构建重组pET-30a-SEB原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3),诱导表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxinB,SEB)。方法利用PCR技术从产SEB的金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC-26075基因组DNA中克隆SEB全长序列,将其克隆到pGEM-TEasy载体中并进行测序。构建pET-30a-SEB原核表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,经镍离子螯合亲和层析纯化后免疫鉴定。结果PCR获得超抗原SEB基因片段,与克隆载体连接后经测序与文献报道的基本一致;成功构建了pET-30a-SEB原核表达质粒且成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约31×103的蛋白。结论成功克隆了seb基因序列,并进行了原核表达和鉴定,获得了SEB蛋白,为后续对超抗原SEB的进一步研究奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的：原核表达呼吸道合胞病毒（RSV）非结构NSl蛋白,并对其免疫特性进行研究。方法采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a（＋）载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Westernblot法鉴定抗体的特异性。结果重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确．经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达．表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42000Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15000Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带。结论NSl基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应。     

金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS原核表达及抗体制备

目的：构建金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白（N-terminal elastin binding proteins of S.aureus,nEBPS）的原核表达系统,制备其多克隆抗体。方法：设计引物,PCR方法扩增nEBPS基因（nebps）,分别构建克隆载体pMD19-T（＋）/nebps和原核表达载体pQE30（＋）/nebps,经PCR、双酶切和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌M15[pREP4],经1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定,经镍螯合亲和层析（Ni-NTAAgrose）纯化后再用SDS-PAGE和WB法鉴定。制备抗原,免疫新英格兰白兔,得到抗血清并对其进行鉴定。结果：pQE30（＋）/nebps重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中较高表达,纯化后得到高纯度的nEBPS,免疫动物后得到理想的多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS在构建的原核表达系统M15[pREP4]中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体。     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT—PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX—1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blowing对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

短穗鱼尾葵花粉泛过敏原profilin基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的克隆并表达短穗鱼尾葵花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白（profilin）。方法利用RT-PCR结合RACE技术克隆短穗鱼尾葵花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个短穗鱼尾葵花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western-blot检测其IgE结合活性。结果克隆获得了短穗鱼尾葵花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基（包括终止密码子）,编码131个氨基酸。该序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.52,相对分子质量约为14200。此序列已被GenBank收录,登陆号为EF173600。重组短穗鱼尾葵花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达,进一步经Ni2＋亲和层析柱纯化后经Western-blot检测具有良好的免疫学活性。结论成功地克隆和表达了短穗鱼尾葵花粉profilin,为短穗鱼尾葵花粉过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础。     

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的 重组表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份。方法 采用DNA重组技术将尿素酶B亚单位3’端732bp基因片段克隆至pET11C载体上，转化宿主菌BL21（DE3）E.coli,IPTG诱导，SDS-PAGE及Western-blot分析表达情况。结果 成功构建了含UreB0.7kb片段的重组质粒pET-UreB0.7，并表达了具有免疫反应性的分子量约28000u的重组蛋白，表达率为19.8%。结论 重组的尿素酶B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础。亦可作为Hp疫苗的成分用于Hp感染的预防和治疗。     

点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

恶性疟原虫信号肽肽酶原核表达载体的构建及融合表达蛋白的鉴定

目的构建恶性疟原虫PfSPP基因pMAL-p2x的原核表达载体,并鉴定表达,为其功能研究奠定基础。方法体外培养恶性疟原虫（3D7株和FCR3株）,提取虫体总RNA,进行反转录后,采用RT-PCR扩增PfSPP的全编码区基因,将其克隆入原核表达载体pMAL-p2x,PCR、双酶切鉴定重组质粒,并进行序列测定,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌进行表达获得MBP-PfSPP融合蛋白,采用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pMAL-PfSPP,转化菌经诱导表达出分子量约为77 000Mr的MBP-PfSPP融合蛋白,抗MBP多克隆抗体可特异性地识别表达的融合蛋白。结论成功表达具有多个跨膜结构的膜蛋白PfSPP,从而为深入研究PfSPP的酶活性及生物学功能奠定基础。     

人IL-10基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的:构建含人IL-10全基因序列的原核表达载体,并进行表达及产物活性的鉴定。方法:利用RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL-10的全长编码序列。编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体PET-28 a( ),构建IL-10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果:表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符,有结合抗体活性。结论:成功地扩增人IL-10全基因序列,并构建了含该基因序列的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性,为下一步制备抗IL-10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...