人FcεRIα亚基的细胞外区的克隆表达和抗血清的制备及功能

为获得有生物活性的FcεRIα亚基细胞外区及多克隆抗体 ,并探知其功能 ,构建FcεRIα亚基的细胞外区的原核表达载体PBAD/gIIIA/FcεRIα,经表达、纯化后用斑点杂交法检测其活性。纯化制品免疫兔子获得抗血清 ,并研究抗血清对FcεRI的作用。结果发现 ,经原核表达出的FcεRIα亚基的细胞外区能与IgE结合 ;获得具有特异性抗FcεRI的抗血清 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒。实验提示原核表达系统能产生有生物学活性的FcεRIα亚基的细胞外区 ,用其制备的抗血清能够识别FcεRIα亚基的细胞外区 ,可能抑制嗜碱粒细胞脱颗粒 ,为研究FcεRIα表达调节、对其的封闭作用及研究过敏性疾病的发病机制奠定物质基础     

人郎罕细胞上的FcεRⅠ

人郎罕细胞能表达ＩｇＥ的高亲和性受体－ＦｃεＲⅠ，这一新发现使人们对此受体的功能有了新的认识，同时也为进一步研究郎罕细胞和其他抗原提呈细胞在特应性疾病的发生中所起的病理生理作用提供了新的方向。     

正常和过敏性哮喘儿童外周血FcεRⅡ阳性细胞与IgE关系的探讨

本文应用单克隆抗体间接免疫荧光染色和流式细胞仪分析技术，对１８名正常儿童和１３名过敏性哮喘儿童外周血淋巴细胞膜表面低亲和力ＩｇＥ受体（ＦｃεＲⅡ）进行测定。结果显示：ＦｃεＲⅡ主要分布于外周血Ｂ淋巴细胞表面。过敏性哮喘儿童外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）和Ｂ细胞中ＦｃεＲⅡ阳性细胞数高于正常对照，并与血清ＩｇＥ浓度呈显著相关。结果表明ＦｃεＲⅡ参与过敏性哮喘儿童体内ＩｇＥ合成的调节过程。     

FcεRⅠ信号传导途径与过敏性疾病的治疗

IgE的高亲合力受体FcεRⅠ在过敏性疾病中充当重要角色。FcεRⅠ所介导的信号传导途径是引起过敏症状的一条主要通路。通过阻断信号通路以治疗过敏性疾病已成为研究的一个焦点 ,本文就FcεRⅠ信号阻断方面的研究进展作一综述。     

086 FcεRⅠ信号传导途径与过敏性疾病的治疗

IgE的高亲合力受体FcεRⅠ在过敏性疾病中充当重要角色。FcεRⅠ所介导的信号传导途径是引起过敏症状的一条主要通路。通过阻断信号通路以治疗过敏性疾病已成为研究的一个焦点，本文就FcεRⅠ信号阻断方面的研究进展作一综述。     

敲除FcεR1加重小鼠非酒精性脂肪肝病

目的探讨Ig E高亲和力受体FcεR1在高脂饮食(HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的作用。方法选取野生型(WT)雄鼠和Ig E高亲和力受体FcεR1敲除(FcεR1-/-)雄鼠各10只,均给予HFD诱导NAFLD模型,每周固定时间称取小鼠体质量。12周后处死小鼠,称取小鼠体质量,收取血及肝组织并检测肝功能相关指标。结果 FcεR1-/-小鼠与WT小鼠相比,体质量增加的同时(P0.05),肝脏体重比增高(P0.05),血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(CHOL)及肝组织TG均升高(P0.01),肝组织Ⅲ型胶原(collagenⅢ)mRNA表达升高(P0.01),NAFLD症状严重。结论 Ig E高亲和力受体FcεR1可能具有保护NAFLD诱导肝损伤的作用,其机制可能是通过降低体质量和改善脂质代谢实现的。     

人IgE分子Fc段受体结合区的表达、纯化及功能鉴定

利用哺乳动物细胞表达、纯化具有生物学功能的人IgE Fc段与受体结合的功能区(Fcε2-4)。以CRL8033细胞株为模板,PCR扩增人IgE Fcε2-4的cDNA并构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,脂质体转染CHO-K1细胞并以G418加压筛选。利用有限稀释法、Dot-blot及FACS筛选出高表达目的蛋白的稳定细胞株并进行扩增。CHO-K1培养上清经偶联抗IgE抗体(Omalizumab)的亲和层析柱分离纯化后,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定纯度,并采用表面等离子共振(SPR)法对该蛋白与其抗体的亲和力进行检测。结果表明,SDS-PAGE显示最终获得了纯度高于95%的人IgE Fcε2-4蛋白,呈二聚体状态,分子量约78kD,SPR检测结果显示,该蛋白与Omalizumab抗体特异性高亲和力结合(kD值约3.8nmol/L)。提示,本实验获得了结构及糖基化修饰正确的人IgE Fcε2-4结构域,为进一步研究其功能及探索新的抗体药物奠定了基础。     

人郎罕细胞上的FcεRⅠ

人郎罕细胞能表达ＩｇＥ的高亲和性受体一ＦｃεＲＩ，这一新发现使人们对此受体的功能有了新的认识，同时也为进一步研究郎罕细胞和其他抗原提呈细胞在特应性疾病的发生中所起的病理生理作用提供了新的方向。     

IgE与其高亲和力受体FcεRⅠ的相互作用

IgE在I型变态反应中起着及其重要的作用,其与效应细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRI)结合,从而触发细胞内一系列信号转导,使肥大细胞发生脱颗粒并释放大量炎性介质是哮喘等过敏性疾病的重要发病机制。本文主要针对IgE及其受体FcεRI的生物学特点以及它们相互结合这一重要步骤的结构研究进行综述。     

人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor(pIgR)的多克隆抗体.方法:在Escherchia coli中分别表达人Fcα/μR的ECl2和pIgR的DI结构域,均以包含体形式存在.从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体的特异性,抗原柱吸收交叉和纯化多抗.结果:抗体滴度分别是1:6 4000和1:25 6000,经Western blot检测特异性良好,抗人Fcα/μR和pIgR的多抗相互没有交叉.结论:在E.coli中成功表达了人Fcα/μR的EC12结构域和pIgR的DI结构域,并制备了无交叉的多克隆抗体,为进一步研究其功能和相互关系奠定基础.     

FcεRⅡ／CD23在支气管哮喘发病中作用的研究

本文以急性发作期病人和缓解期病人及正常人各２０例为研究对象，探讨ＩＬ－４－ＦｃεＲⅡ／ＣＤ２３－ＩｇＥ在支气管哮喘中的调节作用。结果表明，急性发作期病人的ＩＬ－４分泌细胞、ＦｃεＲⅡ／ＣＤ２３阳性淋巴细胞和血清总ＩｇＥ水平均明显高于缓解期病人和正常对照组。在急性发作时，ＩＬ－４和ＣＤ２３之间存在着正相关。进一步表明病人体内ＩＬ－４水平升高可以诱导淋巴细胞表面ＦｃεＲⅡ／ＣＤ２３分子表达的增强，并在ＩｇＥ抗体形成中起着重要作用。     

Fcγ和Fcε受体在小鼠三叉神经节的表达

目的 检测正常小鼠三叉神经节(TG)是否表达免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白E(IgE) Fc段Fcγ受体和Fcε受体,及其在过敏小鼠TG中的变化.方法 通过腹腔注射OVA和铝剂,建立小鼠过敏性结膜炎(ACJ)模型.EHSA检测血清总IgE.用Westernblot和免疫荧光检测Fcγ受体和Fcε受体的表达.结果 小鼠TG表达Fcγ受体和Fcε受体.其中IgG激活型高亲和力受体FcγRI和抑制型低亲和力受体FcγRⅡ只表达在小鼠TG神经元上,而IgG激活型低亲和力受体FcγRⅢ表达在小鼠TG中的卫星胶质细胞上.IgE激活型高亲和力受体FcεR Ⅰ表达在小鼠TG神经元上,而IgE低亲和力受体FcεRⅡ同时表达在小鼠TG神经元和卫星胶质细胞上.与正常小鼠比较,ACJ小鼠的血清总IgE水平升高,TG的FcεR Ⅰ和FcγRⅡ表达增加(P＜0.05).而ACJ小鼠的FcεRⅡ和FcγRⅠ表达下降(P＜0.05).FcγRⅢ在正常和ACJ小鼠TG中的表达无显著差别.结论 小鼠TG表达的Fcγ和Fcε受体可能参与ACJ及其他过敏性疾病的发生和发展.     

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化

目的:探讨人FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白的原核表达纯化及其在体外与IgG的结合活性。方法:PCR方法从人的外周血白细胞中扩增出huFcγRⅠORF区全长基因并与T载体链接,从克隆载体huFcγRⅠ-T中扩增huFcγRⅠ胞外区基因,并将其装入原核表达载体pGEX-6p-1。构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:扩增到了huFcγRⅠ的胞外区基因,所构建的pGEXhuFcγRⅠ重组质粒经PCR和酶切鉴定与预期一致。IPTG诱导下目的蛋白的表达率约为30%。SDS-PAGE结果显示表达的目的相对分子质量(Mr)56 700与理论预期值一致。West-ern blot结果显示原核表达的huFcγRⅠ胞外区蛋白与人IgG特异亲和。结论:FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白在原核表达系统中得到有效的表达,复性蛋白在体外与人的IgG特异结合。     

抗Fc受体γ链单克隆抗体的研制及生物学特性鉴定

目的:制备Fc受体γ链的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性进行鉴定,为研究受体γ链相关的疾病提供实验材料。方法:人工合成的蛋白多肽偶联后免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法筛选阳性克隆,Western blot、流式细胞术(FCM)检测鉴定抗体的特性及抗原识别位点。结果:通过细胞融合和亚克隆,共筛选出3株能稳定分泌抗体并且反应性好的杂交瘤细胞株5B6、7D3和8D4。其中7D3抗体反应性最强,2.5μg/mL与体内体外的γ链都能特异性反应。结论:获得了抗Fc受体γ链特异性的mAb,为进一步研究Fc受体γ链在相关疾病发生发展过程中所发挥的作用提供了良好的研究手段。     

抗重组志贺毒素ⅡB亚基单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 制备出高效价的抗重组志贺毒素ⅡB亚基(rStx2B)单克隆抗体.方法 以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞;运用细胞杂交瘤技术制备,运用间接ELISA法筛选产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株;体内诱生法产生腹水,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚型,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株Stx2B-1H9、Stx2B-1H10、Stx2B-3E5,Ig亚型分别为IgG1κ型,IgG2aκ型,IgG2bκ型,亲和力常数分别为7.36×108、6.94×108、5.85×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗rStx2B的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高,为应用这些单克隆抗体建立免疫亲和层析法纯化天然志贺毒素Ⅱ,鉴定Stx2B的表位,研究针对EHEC O157:H7感染的治疗性抗体奠定了基础.     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组人心肌肌钙蛋白I（rhcTnI）的单克隆抗体,并对其单克隆抗体的特性进行鉴定。方法利用纯化后的rhcTn I作为免疫原,常规免疫Balb／c小鼠．取其脾细胞与同系骨髓瘤细胞Sp2／0进行常规融合。用甲基纤维素半固体培养基法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株,利用ELISA、Western blot等方法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果筛选出3株稳定分泌抗rhcTnI的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4B3、7D5和3E6。 3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgGl（4B3、7D5）和IgG2b（3E6）。3株单克隆抗体与rhcTnI发生特异性结合,而与大肠杆菌菌体蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）无特异性交叉反应,3株单克隆抗体的亲和力常数分别为1．76×10^9L／mol、1．43×10^9L/mol和1．04×10^9L/mol。结论获得了效价高、特异性好的抗rhcTnI的单克隆抗体,为cTnI诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

FcεR I信号传导途径与过敏性疾病的治疗

IgE的高亲合力受体FcεR I在过敏性疾病中充当重要角色。FcεR I所介导的信号传导途径是引起过敏症状的一条主要通路。通过阻断信号通路以治疗过敏性疾病已成为研究的一个焦点，本文就FcεR I信号阻断方面的研究进展作一综述。     

IgA受体FcαRI与CLK1蛋白激酶相互作用的鉴定

目的:研究FcɑRI在没有FcRγ链的情况下,能否与细胞中其他蛋白结合调节细胞功能。方法:利用酵母双杂交、蛋白与蛋白相互作用、激光共聚焦、受体交联等方法研究细胞内与FcɑRI结合的分子。结果:发现FcαRI在体内和体外能够直接与hCLK1蛋白激酶相互作用,并且确定了hCLK1所编码的386~399位氨基酸EHLAMMERILGPLP为两者相互作用的关键区域,同时交联人外周血中性粒细胞FcɑRI受体后发现,hCLK1仍然和FcɑRI结合在一起。结论:除了FcɑRI与FcRγ链相互作用引起细胞功能以外,FcɑRI与CLK1蛋白酶的相互作用可能在IgA炎症疾病反应中发挥重要作用。     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。