表达HBV的SMMC-7721人肝癌细胞系模型的建立

目的：建立表达ＨＢＶ的体外培养的细胞克隆，为研究ＨＢＶ的生物学性状提供良好的细胞模型。方法：将３．２ｋｂＨＢＶ ＤＮＡ插入携带新霉素抗药基因的真核细胞表达载体ｐＣＮＣＸ，应用磷酸钙沉淀技术将其导入体外培养的ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞系。结果：成功地获得表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的细胞克隆。结论：应用磷酸钙沉淀技术将ＨＢＶ ＤＮＡ导入体外培养的细胞克隆，获得能表达ＨＢＶ的细胞克隆，为研究ＨＢＶ表达     

两种HBV全基因组克隆方法的比较

目的通过比较血清HBVDNA水平对一片段PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全基因组克隆效率的影响,选择出合适的HBV全基因组克隆技术,供后续的HBV的基础和临床研究。方法采集了乙型肝炎患者85份血清,分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体,进行HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量PCR法检测上述85份血清的HBVDNA滴度。结果本研究建立的一片段法扩增成功需要的血清HBVDNA浓度高于二片段法,两种方法扩增的效率比较为一片段方法扩增的成功率低于二片段方法(P<0.05)。一片段方法的保真性:核苷酸的人为突变率为1.13bp/kb。灵敏度:为102个初始模板,大于103的重组质粒DNA80%可以成功扩增,浓度低于该值的扩增效率比较低。结论血清HBVDNA水平对两种扩增方法的成功率有一定影响,滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBVDNA滴度大于103copies/ml的样本,可选用一片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术,而对HBVDNA滴度小于103copies/ml样本,则可选用两片段法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好方法,但需进一步优化。     

乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态模型。方法 体外连接HBV DNA获得6．4kb的双拷贝DNA片段,然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点,通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒,再通过脂质体介导法转染肝癌细胞。结果 通过G418筛选,对阳性克隆细胞进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析,证明已将HBV全基因重组真核表达质粒转染至肝癌细胞并获得稳定表达。结论 通过脂质体介导法将HBV全基因转染至肝癌细胞,成功建立了HBV复制状态的细胞模型。     

血清中乙型肝炎病毒全基因组及X基因的克隆与鉴定

目的:建立从血清样品直接扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长DNA的方法,构建HBV全基因组克隆.方法:用长链PCR从血清样品一次性扩增HBV全长DNA,测序鉴定后插入质粒puc19构建含HBV全基因组的重组质粒,再从重组质粒扩增X基因并进行序列分析.结果:经DNA序列测定和酶切分析,获得HBV全基因组克隆,从克隆的HBV全基因组扩增到X基因.结论:从血清中可直接扩增到HBV全基因组DNA,为整体水平研究HBV基因组的变异与其致病及宿主抗感染免疫之间的关系奠定了实验基础.     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)全基因组C区L97和V60突变质粒,并检测其生物学活性。方法采用定点突变技术将HBVadr1.2拷贝基因组质粒p3.8Ⅱ进行C区点突变,构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞,Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制,ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果测序结果表明所构建的突变质粒p3.8L97和p3.8V60分别为nt2189A→C和nt2086C→G,突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论所构建HBV(adr型)全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

中国株乙型肝炎病毒全基因组克隆的制备与鉴定

目的：扩增全长HBV DNA基因组，建立中国株HBV感染性克隆，阐述HBV基因组变异对其不同基因生物学特性影响。方法：TD－PCR和XL－PCR技术一次扩增HBV全长基因组，克隆，PCR、酶切和测序鉴定，结果：通过PCR、酶切，测序鉴定和真核细胞转染分析，获得全长HBV基因组克隆。结论：获得了HBV全基因组克隆，在真核细胞中可以表达HBsAg，为建立HBV感染性克隆奠定物质基础。     

基于全基因组克隆分析乙型肝炎病毒变异株的结构和功能

乙型肝炎病毒(HBV)全基因组克隆的体外培养可用来分析HBV变异株的结构和功能变化。利用该方法发现,HBV表面抗原129L突变体具有正常的抗-HBs结合效率,但其降低了免疫原性,从而导致HBV的持续感染;来自重型乙型肝炎患者的HBV株并不都具有高复制效率,其诱导抗-HBs的能力可能与重型乙型肝炎的发病机制有关;来自肝癌患者的HBV株的高效复制可能是宿主免疫病理反应增强的原因;HBV耐药突变并非都引起病毒反弹,仅根据病毒载量监测药物治疗失败可能导致误判。     

1.1倍全长HBV基因组克隆转染细胞系的建立

目的构建pneo-CH9/3091真核表达质粒,并建立其稳定表达的HepG2细胞系。方法质粒pCH9/3091包含HBV1.1倍体和CMV启动子,将PCR扩增出的带有新霉素(neo)抗性的基因片段插入pCH9/3091构建成重组质粒pneo-CH9/3091。重组质粒经酶切,测序验证正确后,通过脂质体介导转入人肝癌细胞HepG2。G418筛选后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所得单克隆细胞培养上清液的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),PCR检测细胞上清液的病毒颗粒,Western blot检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达,以及Southern blot检测细胞内核心颗粒HBV DNA的复制情况。结果有3株细胞系培养上清HBsAg和HBeAg检测呈现阳性,且HBV C区片段可通过PCR扩增出来,West-ern bot结果提示只有细胞株HepG2-H7可以表达HBV核心蛋白。Southern blot结果说明此细胞株基因组中有HBV基因组的稳定整合,并且能在细胞内检测出HBV DNA复制中间体。结论成功构建1株HBV稳定整合细胞株HepG2-H7,能持续产生HBV病毒颗粒。     

乙型肝炎病毒DNA转染人T淋巴细胞株的研究

本文试用磷酸钙DNA共沉淀法将HBV DNA转染于培养的人T淋巴细胞株-CEM细胞中,HBV可在转染后的细胞中复制和转录,转染后的细胞培养液中,用酶联免疫吸附法可检测出HBsAg,细胞中可检测出3.2Kb和2.2Kb的HBV DNA片段,HBV DNA对体外培养的人 T淋巴细胞株的成功转染将有助于HBV致病机理的研究。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立 ＨＢＶ复制状态模型。方法体 外连接 ＨＢＶ（ａｙｗ亚型） ＤＮＡ获得 ６．４ ｋｂ的双拷贝 ＤＮＡ片段,然后将其插入 ｐｃＤＮＡ３载体的 ＥｃｏＲＶ位点。结果通过 聚合酶链反应（ＰＣＲ）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝ＨＢＶ全基因重组真核表达质粒。结论成功构建了ＨＢＶ 全基因重组真核表达质粒。     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em;分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm,再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3,1（-）,构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm,经酶切鉴定及测序正确后,通过脂质体转染至P815细胞,持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT—PCR,IFA,Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm,建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体,稳定转染P815细胞,为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．     

转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的了解丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p5 3表达的影响 ,探讨其在肝癌发生中的作用 ,及其发生机制。方法使用脂质体介导法 ,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2 NS4B及突变型p5 3基因重组质粒P5 3 CX2 2AN3进入Chang肝细胞内 ,并用G4 18筛选获得稳定表达细胞 ,分别采用细胞化学法检测p5 3表达率。设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组 ,转染p5 3组、共转染NS4B及p5 3组。结果空白对照组无p5 3表达 ,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达 ,转染p5 3组及共转染组呈阳性表达 ,与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较有显著差异 ,P <0 .0 1。结论NS4B可能抑制突变型p5 3表达 ,也可能阻止其进入细胞核。     

HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究

目的 :建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验方法 .方法 :培养HepG2细胞传至 6孔板中 1 2h后 ,加2 0mL·L-1 DMSO继续孵育 1 2h .而后进行HBV阳性血清体外感染HepG2的实验 .感染组用HBV阳性血清 ,阴性对照组用HBV阴性血清 ,空白对照组用DMEM培养基 .实验开始后HepG2细胞在 2 0mL·L-1 DMSO的浓度下继续孵育 2 4h ,而后用PBS清洗 ,洗 8次 ,PBS洗后每隔 1 2h收集一次细胞培养上清 .ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg.PCR检测细胞培养上清和HepG2细胞中的HBVDNA .结果 :HBV阳性血清感染组 ,在PBS洗后 1 2h的细胞培养上清中ELISA检测到HBsAg阳性 (A =0 .8) .PCR检测显示HBV阳性血清感染组细胞培养上清和HepG2细胞中HBVDNA阳性 ,阴性对照组和空白对照组HBVDNA阴性 .结论 :在一定条件下用HBV阳性血清进行HBV感染体外培养的HepG2细胞是可行的     

Molecular Characterization of Duck Hepatitis B Virus Isolated from Hubei Brown Ducks

The objective of this study was to characterize the genome structure of duck hepatitis B virus (DHBV) isolated from Hubei brown ducks. The natural carrier rate of DHBV in adult ducks from Hubei area was investigated and the DHBV DNA-positive serum screened out. The complete genome of a DHBV strain was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into T vector and sequenced. The results showed that the carrier rate of DHBV in Hubei brown ducks was 10 %. This strain (GenBank accession number DQ276978) had a genome of 3024 nucleotides with three overlapping open reading frames encoding the surface, core and polymerase proteins respectively. Comparison of the strain with 17 DHBV strains registered in GenBank revealed a homology from 89.3 % to 93.5 % at the nucleotide level. The sequences of the structural and functional domains of these proteins were highly conserved. The strain was found to share more signature amino acids in the polymerase genes with the "Chinese" DHBV strains than those of the "Western" country strains. This finding was also corroborated by a phylogenetic tree analysis. Therefore, the DQ276978 might belong to a subtype of the Chinese DHBV strains.     

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。     

急性戊肝与慢性乙肝重叠感染的临床研究

目的了解急性戊肝与慢性乙肝重叠感染的临床特点及影响散发性戊肝发病的危险因素,探讨选择合理治疗方案减少重叠感染重型肝炎的发生率和病死率。方法2004年1月至2010年12月住院诊断为急性戊肝患者115例,将慢性乙肝重叠HEV感染（简称戊乙肝）与单纯HEV感染进行对照研究。结果115例戊型肝炎均为急性起病,平均年龄（42±15）岁,其中戊乙肝44例,单纯戊肝71例;男女比例2．83：1。戊乙肝组入院时重度黄疸（总胆红素〉200μmol／L）、重度凝血功能异常（凝血酶原活动度〈40％）、低蛋白血症的发生率明显高于单纯戊肝组（P〈0．05）;戊乙肝组肝性脑病发生率为15．90％,明显高于单纯戊肝组（P〈0．05）;戊乙肝组重型肝炎发生率为38．64％,病死率为35．29％,明显高于单纯戊肝组（P〈0．05）;人工肝支持系统（ALSS）＋内科综合治疗可提高重型肝炎存活率（P〈0．05）。结论海鲜食用史是戊肝发病的主要危险因素;慢性乙肝重叠HEV急性感染易导致慢性乙型肝炎病情加重,易发生重型肝炎,病死率高;在内科综合治疗基础上,早期使用ALSS可明显降低重型肝炎的病死率。     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的为研究乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)20/21bp部分缺失(nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果变异株分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论HBVCP20/21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。