结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：了解结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药的临床分离株embB基因突变的情况，并探索快速检测结核分枝杆菌EMB耐药性的实验方法。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和PCR扩增产物测序方法。分析结核分枝杆菌EMB耐药和敏感各30株的embB基因。结果：以结核分枝杆菌H37RV标准株为对照。发现30株EMB耐药株中有11株(36．7％)embB基因扩增产物SSCP泳动异常，部分耐药菌株测序分析证实为306位密码子突变；而30株敏感株的embB基因扩增产物SSCP泳动均无异常。结论：embB基因突变是结核分枝杆菌EMB耐药的重要机制之一；PCR-SSCP技术可能成为一种检测结核分枝杆菌EMB耐药性的准确和快速的实验方法。     

结核分枝杆菌embB基因突变检测的研究进展

乙胺丁醇（EMB）是具有广谱抗分枝杆菌活性的一线抗结核合成药物。被广泛应用于结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等多种非结核分枝杆菌感染的治疗。近年来。结核病疫情呈上升趋势．其耐药问题也日趋严峻，乙胺丁醇（EMB）作为主要的抗结核药物，在原发和复发结核病患者中的耐药率有上升趋势．据报道在一些国家获得性EMB耐药率已达13．7％。有研究表明MTB耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因EMB操纵子突变或EMB蛋白过度表达有关。该操纵子由embA、embB、embC3个基因组成．其中embB基因（尤其是306位密码子）突变是EMB耐药的主要原因。现就EMB的药理作用、耐药机制、检测方法做一综述。     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究

目的 研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)embB306位点及其他突变位点与乙胺丁醇(ethambutol,EMB)的耐药表型及耐多药(multidrug resistant,MDR)的关系;分析embB基因突变与EMB药敏表型及MDR的关系. 方法 对临床分离的MTB采用BD MGIT 960 SIRE试剂比例法进行药敏试验,取48株EMB耐药、46株EMB敏感但耐其他药及7株四药均敏感MTB提取核酸并扩增embB基因全序列,对扩增产物进行测序分析embB基因序列,与H37Rv标准株序列比对,分析embB基因各突变位点、形式及频率. 结果 101株MTB发现embB基因序列上有17个不同位点突变形式.53株MTB在embB基因序列上发生突变,其中46株为EMB耐药,7株为EMB敏感;embB基因野生型的MTB有48株,其中2株为EMB耐药,46株为EMB敏感;embB突变型与embB野生型的MTB之间EMB耐药率有显著性差异(x2=68.95,P＜0.01).101株MTB中MDR有51株,其中有42株发生embB突变,9株为embB基因野生型,embB基因突变率在MDR和非MDR之间有显著性差异(x2=36.9,P＜0.01). 结论 embB306位点与EMB耐药及MDR中度相关,embB基因突变与EMB耐药及耐多药结核菌(multidrug resistant-Mycobacteriumtuberculosis,MDR-TB)高度相关,embB基因突变可作为MDR-TB的检测分子标记物,指导临床用药.     

耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究

目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性. 方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,2检验分析二者之间的相关性. 结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2%)对EMB耐药,41株(48.8%)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9%)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0%),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5%),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(2=25.58,P=0.00).embB306是最常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(2=12.37,P=0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0%和65.1%,58.5%和73.2%,76.2%和69.0%. 结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.     

结核分枝杆菌耐多药的基因研究

目的 探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 用聚合酶链反应和聚合酶链反应单链构象多态性分析对128株结分村以杆菌临床分离析耐利福平（rpoB)、链霉素（rpsL)和异烟肼（KatG）基因检测。结果 38株 敏感株中,各有1株（206%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;90株耐多药析中,分别有81株（90.0%)、71株（78.9%)和63株（70.0%)测出rpoB、rpsL和KatG突变;有77株（85.6%)同时测出2种以上耐药基因突变;10株耐其他药物株中,仅有1株测出KatG基因突变。结论 85.6%的耐多药结核分枝杆菌存在2种以上耐药基因突变,且耐药基因突变率与耐药浓度有关。     

广西结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因突变特征

目的 了解广西壮族自治区结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药基因突变特征及其影响因素,为结核病的分子诊断和临床治疗用药提供依据。方法 对2018-2019年广西30个结核病耐药监测点连续不间断收集的655株结核分枝杆菌(其中52株乙胺丁醇耐药菌株,603株乙胺丁醇敏感菌株)进行全基因组测序,分析乙胺丁醇耐药基因突变特征及其影响因素。结果 655株结核分枝杆菌中,54株发生乙胺丁醇耐药基因突变,突变率为8.24%(54/655)。在比例法检测EMB耐药的52株菌株中,21株发生基因突变,突变率为40.38%(21/52);603株EMB敏感株中,33株发生基因突变,突变率为5.47%(33/603),耐药株中的基因突变率高于敏感株(χ²=77.133,P=0.000)。EMB耐药表型与基因突变的符合率为40.38%(21/52),二者检测结果吻合度不高(Kappa值=0.343,P <0.001)。54株发生基因突变的菌株,突变基因为emb A、emb B和emb C,突变形式有20种,其中单位点突变29株,占53.70%(29/54),联合位点突变25株,占4...     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验的系统评价

目的系统评价各种检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验方法的准确性。方法计算机检索PubMed、EMbase等数据库,并手工检索相关期刊,全面收集结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验的研究,依据QUADAS评价纳入诊断试验的质量,并对结果进行Meta分析。结果最终纳入9个研究。Meta分析结果显示：硝酸盐还原法与比例法相比,以及BACTEC MGIT 960与BACTEC 460 TB相比,其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及SROC曲线下面积分别为92%、99%、30.50、0.13、0.9752和93%、92%、6.27、0.11、0.9;MB/BacT,噬菌体生物扩增法亦显示了较好的检验效能。结论硝酸盐还原试验可代替比例法作为结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的筛查试验;BACTEC MGIT 960可代替BACTEC 460检测系统作为结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的确诊试验。     

PCR-SSCP快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株的研究

目的：应用分子生物学方法快速鉴别结核、非结核分枝杆菌临床分离株。方法：通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核、非结核分枝杆菌。结果：98株临床分离株中，经细胞学鉴定93株为结核分枝杆菌复合群，5株非结核分枝杆菌。用引物I、Ⅱ对结核分枝杆菌复合群进行PCR－SSCP析，有81株与标准株有相似图谱。用引物Ⅲ、Ⅳ对非结核分枝杆菌进行PCR－SSCP分析，均显示出与结核分枝杆菌标准株不同的电泳图谱。结论：PCR－SSCP可快速鉴别结核、非结核分枝杆菌。     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

结核分枝杆菌链霉素耐药分离株rpsL基因突变的检测

目的 探讨结核分枝杆菌（结核菌）对链霉素（Ｓｍ）产生耐药性的分子机制,建立直接快速检测结核菌Ｓｍ药物敏感性的试验方法。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染分析技术检测３２例结核菌临床分离株的ｒｐｓＬ基因。结果 以结核菌标准株（Ｈ３７Ｒｖ）为对照,３２株结核菌临床分离株中,１０株Ｓｍ敏感株的ｒｐｓＬ基因未见ＳＳＣＰ泳动异常,２２株Ｓｍ耐药株中,１６株（７２．７％）的ｒｐｓＬ     

载脂蛋白E基因多态性检测技术的对比性研究

目的建立并比较载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）基因多态性检测技术,为ＡｐｏＥ基因分型提供良好的方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ单链构象多态性（ＳＳＣＰ）检测技术对１１０例患者及相同人数的正常人进行ＡｐｏＥ基因型检测和分析。结果应用ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ技术测得正常对照组：ε２／２（０,０．０２０）,ε３／３（０．７００,０．７６０）,ε４／４（０,０．０４０）,ε２／３（０．１００,０．０６０）,ε２／４（０,０．０２０）,ε３／４（０．２００,０．１００）,ε２（０．０５０,０．０６０）,ε３（０．８５０,０．８４０）,ε４（０．１００,０．１００）。经χ２检验,ＡｐｏＥ基因型频率和等位基因频率的差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。上两种检测技术与既往两种检测技术（ＩＥＦ,ＷｅｓｔｅｒｐＢｌｏｔｉｎｇ）的结果经χ２检验,其ＡｐｏＥ等位基因频率的差异也无显著意义（Ｐ＞０．０５）,均符合中国汉族人ＡｐｏＥ基因频率分布。结论ＰＣＲＲＦＬＰ方法是一种稳定可靠的ＡｐｏＥ基因多态性分析方法,多重ＰＣＲＳＳＣＰ技术更加简便有效,使ＡｐｏＥ基因多态性的研究更加完善。     

非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨

目的：建立一种省时简便和灵敏可靠的检测筛查基因点突变的方法，即PCR-SSCP(PCR-Sjngle stand conformation polymotphism)银染分析技术。方法：应用改进的PCR-SSCP银染分析技术，检测妊娠期胆内胆汁淤积症患者外周血基因组DNA中MDR3基因外显子14的点突变情况。结果：非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳在有冷水循环装置控制下，结果稳定可靠，受环境温度影响小；但银染时，需根据室温调整染色时间及显影液的配制，当室温高于25℃时，碳酸钠需预冷，有利于控制背景色，得到更为满意的结果。结论：利用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法筛查目的基因的点突情况，具有省时简便和灵敏可靠的特点，且重复性好，避免了盲目测序及资金浪费。     

多重聚合酶链反应检测超广谱β内酰胺酶方法的研究

目的 建立超广谱β内酰胺酶(ESBLs)多重聚合酶链反应(multiplex PCR)的检测方法并对其进行应用评价。方法 通过排序比较选择TEM、SHV和CTX—M型基因编码区保守序列设计型特异性通用引物，建立多重PCR体系，对产ESBLs标准株及54个疑产ESBLs临床分离株进行ESBLs的检测，并通过PCR产物克隆测序及美国临床实验室标准化委员会表型确认试验的平行检测，对该法进行应用评价。结果 多重PCR法对纸片法阳性株及阴性株ESBLs检出率分别为94．3％(33／35)和26．3％(5／19)；测序结果证实了该法的特异性，且敏感性较高。84．2％(32／38)ESBLs基因型为CTX—M型，15．8％(6／38)为SHV型。结论 该法的建立为临床检测ESBLs及其分子流行病学研究提供了一种特异和敏感的工具。