黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外黄芪诱导分化为神经元样细胞.方法 通过密度梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞进行培养,观察细胞的形态和生长情况,分离纯化,传代扩增.采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态变化,以免疫组织化学染色方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.用RT-PCR方法半定量分析相关基因neurogenin-1(Ngn-1)和Wnt-1基因在诱导过程中的表达.结果 经传代后,骨髓间充质干细胞呈纤维细胞样,有较强的增殖能力.经黄芪诱导后,细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP表达阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞.Ngn-1和Wnt-1基因在黄芪诱导后明显上调.结论 大鼠骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,并在黄芪诱导下向神经元样细胞分化.Ngn-1和Wnt-1基因在其分化过程中起正调控作用.     

成人脂肪基质细胞体外诱导星形胶质细胞的形态学和超微结构研究

目的 研究成人脂肪基质细胞(ADSC)诱导分化前、后细胞的生物学特性和超微结构特征.方法 体外分离、培养ADSC,应用化学诱导剂对其进行诱导,倒置显微镜下观察ADSC及其诱导分化细胞的形态;免疫细胞化学检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况;Real-time PCR检测ADSC诱导分化前、后Nestin、GFAP基因mRNA的表达情况;透射电镜观察诱导分化细胞的超微结构.结果 体外培养的ADSC形态类似成纤维细胞,可在体外稳定扩增10代以上.诱导分化的细胞具有星形胶质细胞的超微结构特征;Nestin在细胞质中呈阳性表达,GFAP在细胞质及细胞核中均呈阳性表达.两种蛋白的阳性表达率在诱导14d时达到高峰分别为:Nestin(14.4 ±3.6)%,GFAP(87.3±5.3)%,此后两种蛋白的阳性表达率保持不变.Nestin及GFAP基因mRNA在诱导前及诱导后(1 d、7d、14d、20d)各时间点均有表达,且mRNA的平均相对浓度随着诱导时间的延长逐渐增高,Nestin在诱导后14d达到最高水平,GFAP在诱导后20d达到最高水平(P<0.05).结论 成人脂肪基质细胞的胞质中具有神经干细胞标志物Nestin的基因遗传物质,可将其诱导分化为具有成熟星形胶质细胞超微结构及GFAP蛋白、基因表达的细胞.     

DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的浓度优化

目的 探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)诱导大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的最适浓度.方法 取妊娠12.5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,DNCP诱导浓度分别为10、50、100、200、500、1 000μg/mL,观察细胞形态变化,诱导6d后采用定量RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的表达.结果 6d后除10μg/mL组和1 000μg/mL组外,其他诱导组细胞出现极性改变,部分细胞出现平行排列趋势;细胞表达DSPP和DMP1,以200μg/mL组最强,500μg/mL组和200μg/mL组表达量相当,而1 000μg/mL组细胞死亡.结论 在DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中过低浓度不利于成牙本质细胞的分化,而过高浓度则引起细胞死亡.200μg/mL是较为合适的有效诱导浓度.     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

三磷酸胞苷二钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 探讨三磷酸胞苷二钠(CTP)诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法 取成年SD大鼠,用贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代扩增,连续观察细胞形态及生长特性.用不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/mL)CTP对BMSCs进行诱导;诱导后用免疫组织化学检测细胞神经微丝蛋白(NF)、胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达.计算阳性细胞比例,进行统计学分析,选出合适的诱导剂量.结果 随CTP浓度增高,经免疫组织化学检测NF、GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势,到一定浓度后又有所下降,统计学分析,CTP浓度为02 mg/mL时,能够诱导NF、GFAP和NSE阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%和(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P＜0.01).结论 CTP是一种很好的体外诱导剂,可以诱导MSCs向神经细胞分化,以0.2 mg/mL CTP作诱导剂,能够获得较明显的诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的结果.     

维甲酸联合神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法:将人脐血间充质干细胞体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA)、维甲酸联合神经生长因子(NGF)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,并比较表达神经元特异性烯醇化酶(NES)mRNA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的差异。结果:两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示三种诱导方法诱导后均表达Nestin、NSE、GFAP,NGF+RA组多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但两种诱导方法诱导后表达上调(P<0.05),添加NGF较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论:脐血MSCs经两种神经营养因子诱导法均可分化为神经样细胞,并表达神经细胞特异性标志物,其中添加NGF后较单纯应用RA诱导效果好。     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

最近研究表明胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)在体内外均可以发育分化出神经组织细胞，这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或者脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。本文就胚胎干细胞定向分化为神经组织细胞及其基因表达特点作一综述。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES cell）体外培养可以分化成为外胚层组织,并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法。方法分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2和Flk-1的表达,并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定。结果在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达。PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为(90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P<0.05)。结论外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法。     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化诱导的途径和方法,为阐明胰岛β-细胞的发育机制和糖尿病的细胞移植治疗奠定基础.方法将传统的多步诱导法改良为两步诱导法,将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多步法进行比较.结果经过两步诱导,胚胎干细胞被诱导成了胰岛素分泌细胞,越过了先将胚胎干细胞诱导为神经前体细胞,再进一步诱导为胰岛素分泌细胞的传统模式,使诱导时间缩短,诱导方法简化,所得胰岛素分泌细胞数量与传统方法所得相当.结论多阶段和两阶段诱导均可将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞.     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

目的：探讨核心蛋白聚糖（ｄｅｃｏｒｉｎ）在肝纤维化形成机制中的作用。方法：在正常人肝细胞株Ｌ－０２及大鼠肝星形细胞株ＨＳＣ－Ｔ６体外培养体系中,分别加入不同质量浓度（０．０１,５,１０μｇ／ｍｌ）ｄｅｃｏｒｉｎ共培养不同时间后,进行细胞计数以及＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－Ｌｅｕ掺入量测定。结果：实验组经０．０１μｇ／ｍｌ ｄｅｃｏｒｉｎ作用４ｄ或６ｄ后,ＨＳＣ－Ｔ６和Ｌ－０２细胞增殖数量以及＾３Ｈ－Ｔ