DNA拓扑异构酶与细胞凋亡

细胞凋亡 (又称细胞程序性死亡 )的调控由多种基因、核内外酶、信号蛋白等成分协同完成 ,其中DNA拓扑异构酶认为是细胞凋亡过程中核内相关的调控因素。作者就近年来对DNA拓扑异构酶的认识及其抑制物诱导细胞凋亡的机制和在细胞凋亡中的作用作一综述     

一种快速灵敏分离凋亡细胞DNA片断的方法

一些资料表明氧应激能导致小鼠胸腺细胞凋亡。用含有２０μｍｏｌ／Ｌ的地氧化氢和０．１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸亚铁的磷酸缓冲液处理胸腺细胞１０ｍｉｎ后去掉处理液，再用含有１０％的小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基在３７℃５％ＣＯ２条件下分别培养０，１，２和４ｈ。测量凋亡细胞的ＤＮＡ片段的百分数，同时比较了两种ＤＮＡ抽提方法对凋亡细胞“ＤＮＡｌａｄｄｅｒ”的影响。结果提示快速一步法抽提凋亡细胞的“ＤＮＡ ｌａｄｄ     

芦笋提取物对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性作用的研究

通过体外ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ介导ＤＮＡ裂解实验观察了芦笋提取物对该酶活性的影响。从小鼠白血病Ｌ１２１０细胞中提取ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ，以ｐＢＲ（３２２）ＤＮＡ为底物，将１μｇＤＮＡ与０．２Ｕ拓扑异构酶Ⅱ温孵，当分别加入芦笋提取物２２０、２２、２．２μｇ／ｍｌ３个终浓度时，裂解能力可提高到原来的５倍，说明该药的直接作用靶点是ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ，而不是直接裂解ＤＮＡ。     

芦笋提取物对DNA拓扑异构酶II活性作用的研究

通过体外ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ介导ＤＮＡ裂解实验观察了芦笋提取物对该酶活性的影响。从鼠白血病Ｌ１２１０细胞中提取ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ，以ｐＢＲ３２２ＤＮＡ为底物，将１μｇＤＮＡ与０．２Ｕ拓扑异构酶ＩＩ温孵，当分别加入芦笋提取物２２０，２２，２．２μｇ／ｍｌ３个终浓度时，裂解能力可提高到原来的５倍，说明该药的直接作用靶点是ＤＮＡ拓扑异构酶ＩＩ，而不是直接裂解ＤＮＡ。     

密蒙花化学成分及其活性研究

目的为了进一步揭示中药密蒙花药理活性物质基础,研究发现活性成分,对中药密蒙花的化学成分及其活性进行系统的研究.方法经过正相、反相硅胶柱,Sephadex LH-20,制备液相等色谱方法反复分离.利用各种波谱数据分析鉴定了11个化合物的结构,并有针对性地对分离得到的化合物进行了醛糖还原酶抑制活性测试和以DNA拓扑异构酶Ⅳ为靶点的抑菌活性筛选.结果分离得到的化合物中,黄酮及其苷类4个,分别是Ⅰ(芹菜素,apigenin)、Ⅱ(蒙花苷,linarin)、Ⅲ(芹菜素-7-O-芸香糖苷,apigenin-7-O-α-L-rhamnopyranosyl(1-6)-β-D-glucopyranoside)和Ⅳ(木犀草素-7-O-葡萄糖苷,luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside);苯乙醇苷4个,分别是Ⅴ(毛蕊花苷,verbascoside,即洋丁香苷,acteoside)、Ⅵ(异洋丁香苷,isoacteoside)、Ⅶ-1&2(cistanoside F a＆b)、Ⅶ-1＆2(campneosideⅡa＆b);三萜皂苷3个,分别是Ⅸ(密蒙花苷A,mimengoside A)、X(密蒙花苷B,mimengoside B)、Ⅺ(songarosideA).活性测试结果表明Ⅲ、Ⅱ、Ⅵ具有较强醛糖还原酶抑制活性,抑制率均高于阳性对照槲皮素;Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅺ对DNA拓扑异构酶Ⅳ均有不同程度的抑制作用,在与环丙沙星相同质量浓度下(1 mg/mL),产生类似的抑制效果.结论11个化合物中,化合物Ⅲ,Ⅶ-1、2,Ⅷ-1、2和Ⅺ为首次从本属植物以及本种植物中分离得到.首次以DNA拓扑异构酶Ⅳ为靶点对密蒙花中的流份及单体化合物进行了抑菌活性筛选测试和醛糖还原酶抑制活性测试,考察结果具有实际指导意义.     

环化小檗碱类似物A55的抗肿瘤活性及其机制研究

目的研究环化小檗碱衍生物（CBBR）A55的抗肿瘤活性及其初步抗肿瘤机制。方法利用磺酰罗丹明B（SRB）法来检测化合物的抑瘤率和半数抑制浓度（IC50）,采用流式细胞分析法来检测细胞周期分布,采用拓扑异构酶抑制实验来检测A55对拓扑异构酶I活性的抑制,采用Hochest和Westernblot实验来检测细胞凋亡以及与细胞DNA断裂修复和凋亡相关的蛋白。结果化合物A55具有较强的抗肿瘤活性,主要是通过抑制拓扑异构酶I的活性来引起DNA断裂,使细胞阻滞在s期并启动凋亡来抑制细胞增殖。结论环化小檗碱新型衍生物A55是一类结构新颖,抑瘤率强,值得进一步开发的新型化合物。     

esp1基因过表达可诱导肿瘤细胞凋亡

目的研究esp1基因转染进入A549细胞后对细胞凋亡的影响.方法将含esp1基因的IRE-EGFP质粒经FUGENE 6 转染试剂转染到肺腺癌细胞A549,用倒置显微镜及流式细胞仪检测转染后细胞染色体数以及转染后细胞凋亡及增殖的情况.结果 esp1基因导入A549细胞后,染色体数目减少,无血清培养后细胞凋亡增加,增殖减少.结论 esp1基因在A549细胞中不但可以显著地改善细胞的非整倍性而且可以有效地抑制细胞恶性增殖、促进细胞凋亡,从而为肺癌的治疗提供了一个新的靶标.     

病毒调控细胞凋亡基因表达的分子生物学研究

细胞凋亡(ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)又称为细胞程序性死亡,是细胞自主死亡的过程,在组织发生、免疫系统克隆选择、机体内环境稳定等诸多方面有着广泛的生物学意义[1]。在某些疾病,如肿瘤、艾滋病等发病机制中也具有重要意义。参与细胞凋亡基因很多,主要有ｂｃ1-2、ｍｙｃ、ｐ53、ｃｅｄ-3、Ｆａｓ/Ａｐｏ-1等。1　细胞凋亡主要调控基因细胞凋亡因子Ｆａｓ/Ａｐｏ-1:Ｆａｓ抗原是介导细胞凋亡的细胞表面蛋白,由319个氨基酸组成,分子量41ＫＤ,Ａｐｏ-1经纯化和ｃＤＮＡ克隆证实与Ｆａｓ为同一物质。Ｆａｓ结构表明,它属于肿瘤坏死因子α受体(ＴＮＦ…     

抗凋亡基因survivin促进细胞转化的作用机制

目的：探讨抗凋亡基因survivin在细胞转化中的作用机制。方法：利用RT－PCR获得survivin编码区序列,双酶切后,将其定向克隆至原核和真核表达载体,生长曲线观察高达到survivin对细胞增殖的影响;软琼脂集落形成实验观察细胞的接触抑制生长能力;WesternBlot检测survivin高表达引起的蛋白质分子改变。结果：通过分子克隆,构建survivin原核和真核表达载体,并可在大肠杆菌和真核细胞中表达。生长曲线表明,转染survivin的293细胞的增殖速度略快于对照细胞,尤其在细胞生长至高密度时;survivin可以明显提高293细胞的软琼脂集落形成能力;survivin的高表达可以引起癌基因cylinD1的蛋白表达水平增高。结论：抗凋亡基因survivin具有促进细胞转化的作用,这种作用可能依赖于cyclinD1和c-myc的功能。     

抗凋亡基因bag-1在乳腺癌组织中的表达及意义

目的 讨论抗凋亡基因bag-1在乳腺癌组织中的表达及意义，了解肿瘤细胞凋亡的特点。方法 采用免疫组化SABC法观察了100例乳腺癌与10例乳腺良性肿瘤及10例正常乳腺组织的石蜡标本切片中bag-1的表达。结果 Bag-1在乳腺癌组织中，乳腺良性肿瘤中，正常乳腺组织中阳性表达率分别为85．0％，10．0％和10．0％，差异明显（P＜0．05）。在I期，Ⅱ期和Ⅲ期的乳腺癌组织中Bag-1阳性表达率分别为87．5％，82．4％和88．2％。三无明显差异（P＞0．05）。在导管癌、小叶癌及特殊型癌中Bag-1阳性表达率分别为85．5％，84．8％和80．0％。无明显差异（P＞0．05。结论 bag-1在乳腺癌组织中高表达,bag-1在乳腺癌组织中的表达与肿瘤的临床分期，病理分型等无关。Bag-1可以作为早期诊断乳腺癌的一种生物标记。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。     

抗凋亡蛋白Bfl-1/hA1的研究进展

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡的调控中发挥了关键作用,Bfl-1/hA1是Bcl-2家族中发现较晚但研究相对比较深入的抗凋亡蛋白家族成员。由于具备特殊的蛋白结构,使其在细胞的抗凋亡机制的上游活化机制以及下游作用机制中扮演了重要的角色,并对炎性反应及血液肿瘤等凋亡相关疾病的发生发展起了重要的作用。这预示着抗凋亡蛋白Bfl-1/hA1将可能作为治疗凋亡相关性疾病的新靶点。     

多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用

目的：研究多囊蛋白1（PC1）对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,为进一步阐明PC1对凋亡的作用提供依据。方法：采用PC1基因重组质粒pEGPF-PC1-5TMC和空白对照质粒pEGFP分别转染HeLa细胞,Western blotting法进行验证。采用MTT法分别检测转染组（转染PC1重组质粒）、空白对照组（转染空白对照质粒pEGFP）和正常对照组（正常HeLa细胞）转染后48和72 h时细胞增殖活性,采用TUNEL法检测转染组和空白对照组细胞凋亡率。结果：转染后48和72 h,与正常对照组比较,转染组细胞增殖活性差异无统计学意义（P>0.05）;与空白对照组比较,转染组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。转染组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P<0.01）。结论：PC1基因对人宫颈癌HeLa细胞有抗凋亡作用。     

银耳多糖抗心肌细胞凋亡作用的实验研究

目的:从细胞及动物整体水平研究银耳多糖(tremella polysaccharides, TP)抗心肌细胞凋亡的作用。方法:采用醇提法提取精制TP,气相色谱法检测TP纯度。对乳鼠心肌细胞原代培养后随机分为正常对照组（A组）,凋亡对照组（B组）和TP预处理组（T组）,72 h后进行形态学观察和锥虫蓝摄取率测定。采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡指数。在动物体内实验中,选择清洁级ICR纯系小鼠100只,按体质量随机分为5组：阴性对照组（N组）每天腹腔注射生理盐水,其余4组每天腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖以建立小鼠衰老模型,同时阳性对照组（C组）每日以生理盐水灌胃,L、M、H组分别以每日100、200、400 mg/kg TP灌胃。8周后处死小鼠,获取心肌标本进行组织学研究和生化检测。结果:培养的各组乳鼠心肌细胞锥虫蓝摄取率：B>C>A（P<0.01）;心肌细胞凋亡指数：B>C>A（P<0.01）。动物实验中,与N组相比,阳性对照组（C组）及各TP干预组心肌均无明显病理学改变。TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数显示：H     

大鼠脑缺血再灌注中iNOS源性NO/ONOO-对Caspase-1蛋白表达的影响

目的探讨大鼠局灶性脑缺血2 h再灌注48 h诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)来源的一氧化氮(nitric oxide,NO)和过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)对Caspase-1蛋白表达的影响.方法闭塞大鼠左侧大脑中动脉造成局灶性脑缺血模型.给予选择性iNOS抑制剂氨基胍,采用硝酸还原酶法检测脑组织NO含量、流式细胞术检测硝基酪氨酸表达、免疫组织化学法检测Caspase-1蛋白表达的变化.结果与单纯缺血/再灌注组比较,腹腔注入氨基胍抑制iNOS活性可使Caspase-1蛋白表达降低.结论大鼠局灶脑缺血再灌注过程中,iNOS来源的NO/ONOO-可促进Caspase-1蛋白表达,这可能是iNOS活性增加促进细胞凋亡的机制之一.     

失巢凋亡过程中整合蛋白α5β1过表达对人肝癌细胞Survivin表达的影响

目的：探讨整合蛋白α5β1过表达引起肝癌细胞凋亡的机理。方法：利用poly—hema使细胞非贴壁生长12h、18h、24h，诱导失巢凋亡。通过Westerm迹法检测Survivin表达量。结果：随着poly—hema诱导时间的增加，α5β1—7721和β1—7721细胞凋亡和死亡率也随之增加，而Survivin表达量则减少，β1—7721细胞的减少程度显著大于α5β1—7721，在18h时减少了55％。结论：Survivin在β1—7721细胞的凋亡过程中所起的作用大于α5β1—7721细胞。     

视网膜母细胞瘤中Fas和bcl-2的表达及意义

目的　探讨Fas及bcl 2在视网膜母细胞瘤的表达及意义。方法　用免疫组织化学SP方法检测了 45例视网膜母细胞瘤及 12例正常视网膜组织中Fas及bcl 2蛋白的表达 ,并进行比较。结果　Fas在视网膜母细胞瘤组织及正常视网膜组织的表达分别为 0 .2 5 5± 0 .441,0 .0 83± 0 .2 89,两者比较差异无显著性 (P =0 .114 8) ,均呈低表达 ;bcl 2在视网膜母细胞瘤中的表达为2 .70 2± 1.0 82 ,与正常视网膜组织中 0 .16 7± 0 .389相比差异具非常显著性 (P <0 .0 0 0 1)。结论　Fas在视网膜母细胞瘤及正常视网膜中均呈低表达 ;而bcl 2在视网膜母细胞瘤中呈明显高表达 ,其可明显抑制凋亡的发生 ,与肿瘤的发展关系密切。     

新基因RS1在辐射损伤小鼠的组织表达谱研究

目的 探讨新基因RS1在辐射损伤小鼠的组织表达谱情况，为RS1的克隆和功能研究提供更多的线索。方法 利用半定量RT—PCR的方法研究RS1在辐射损伤小鼠肠上皮、肝、肾、脾脏的表达情况，利用原位杂交的方法观察RS1在辐射损伤小鼠肝、肾、脾脏和心肌的表达情况。结果 RS1在辐射损伤小鼠除在肠上皮表达以外，在。肾、肝、脾等多处表达，其中脾脏和。肾脏的表达较高。结论 RS1具有广泛的组织表达谱。可以利用肾脏和肝脏来源的，RS1表达丰度高的总RNA为模板进行全长cDNA克隆。