硫氧化还原蛋白对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用

目的 探讨硫氧化还原蛋白(Trx)对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用。方法 通过RT-PCR从人胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR细胞中克隆Trx全长cDNA,构建Trx正反义真核表达载体,并借助脂质体将正义载体转入胃癌细胞SGC7901、反义载体转入胃癌耐药细胞SGC7901／VCR,利用MTT试验在体外检测基因转染细胞及其对照细胞对化疗药物的敏感性。结果 转染Trx正义载体后,SGC7901细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著降低;转染Trx反义载体后,SGC7901／VCR细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著升高。结论 Trx可能参与了胃癌细胞多药耐药性的形成,改变Trx的表达水平可以调节胃癌细胞的化疗敏感性。     

锌带蛋白基因ZNRD1高表达胃癌细胞模型的建立

为建立高表达ZNRD1胃癌细胞模型，通过分子克隆技术将ZNRD1基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定，经显微注射将重组质粒导入人胃癌细胞SGC7901，G418筛选后应用Nothern blot检测ZNRD1基因的表达。结果经酶切鉴定证实正确地构建了真核表达质粒，转染SGC7901细胞后获得有效表达。表明已成功地构建ZNRD1基因真核表达载体，并经显微注射法建立了高表达锌带蛋白基因ZNRD1的胃癌细胞模型，为深入研究ZNRD1的作用和机制奠定了基础。     

电压门控钾通道Kv1.5反义核酸对胃癌细胞SGC7901生长的抑制作用

目的构建电压门控钾通道Kv1．5分子的反义核酸(Kv1．5AS)的真核表达载体,建立Kv1．5AS转染的胃癌SGC7901细胞亚系,探讨Kv1．5分子对胃癌细胞生长的抑制作用。方法通过DNA重组技术,将Kv1．5全长eDNA片段从pBKKvl．5载体反向亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1,构建表达Kv1．5反义核酸的重组载体pcDNA3．1-Kv1．5AS。借助脂质体将pcDNA3．1-Kv1．5AS转导入胃癌细胞SGC7901。通过MTT实验绘制细胞生长曲线,肿瘤细胞集落形成实验检测集落形成率,流式细胞仪进行细胞周期分析,并利用Western blot检测Kv1．5和CyclinD1蛋白在基因转染细胞中的表达。结果限制性酶切鉴定结果提示,重组载体peDNA3．1-Kvl．5AS构建成功。Western blot结果表明,转染pcDNA3．1-Kv1．5AS后,Kv1．5蛋白在SGC7901细胞中的表达显著降低。与转染空载体的对照细胞相比,转染Kv1．5AS表达载体后,SGC7901细胞生长变缓,集落形成率显著降低,细胞发生了G1期阻滞。Western blot结果证实,CydinD1蛋白在Kv1．5AS转染细胞中表达降低。结论电压门控钾通道Kv1．5反义核酸可抑制胃癌细胞SGC7901的生长。     

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1 Ag参与耐药的分子机制奠定了基础     

p38信号途径与胃癌细胞职霉素耐药相关

研究p38MAPK信号转导途径在胃癌耐药机制中的意义。用免疫共沉淀法及Wwstern boltting实验分另研究阿霉素处理胃癌细胞SGC7901及癌细胞SGC7901／VCR细胞后,p38激酶活性及量的变化。结果显示,阿霉素处理胃癌多药耐药SGC7901／VCR细胞15min后,p38MAPK活性增强,呈时间依赖性,而p38MAPK量无明显变化,提示肿化疗药物阿霉素可诱导肿瘤耐药细胞p38激酶活性降低,且可诱导非耐药细胞p38激酶活性增强。     

MG7Ag在胃癌细胞系SGC7901及其耐药亚系中的表达及功能

探讨MG7Ag在胃癌药敏细胞系SGC7901及其耐药亚系SGC7901／VC40．3、SGC7901／VCR0．7、SGC7901／VCR1．0中的表达及功能。采用免疫细胞化学方法及流式细胞仪观察MG7Ag在胃癌药敏细胞及其厕细胞系的一,用MTT法检测单克隆抗体MG7对药物敏感的性的影响,对阿霉素作为荧光标记用流式细胞仪观察,MG7对细胞内药物浓度的 影响,结果表明,MG7Ag在耐药细胞系的表达较药敏细胞明显增加,且随耐药指数的增加呈逐渐增加的趋势,胃癌药敏细胞及其耐药细胞与MG7工同孵育后,对长春新碱的药物敏感性减低;MG7与耐药细胞共同孵育后,细胞内阿霉素的浓度减低。MG7Ag可能作为一个新的与胃癌耐相关的分子,在维持胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR的耐药表型中起重要作用。     

一条肺癌多药耐药相关基因的功能鉴定及染色体定位

目的 进一步分析从肺癌多药耐药细胞株(SPC-A-1／CDDP)克隆出的差异表达基因染色体的定位,并鉴定其耐药相关功能。方法 登录美国国家生物技术信息中心网(www.ncbi．nlm．nih．gov),根据克隆的目的基因序列数据,查询人类基因库,分析确定该基因在人类染色体上的位置。以DNA重组技术构建该目的基因的反义表达载体。电穿孔法将其转染多药耐药细胞株SPC-A-1／CDDP,采用半定量RT-PCR研究该基因表达受抑情况,并以MTT法分析转染细胞对几种化疗药物的敏感性改变。结果 电子信息学确定该目的基因定位在人类染色体的19q13．3～19q13．4位点上。成功构建该基因的反义表达载体,转染反义表达载体的SPC-A-1／CDDP细胞的目的基因mRNA含量明显减少,即基因表达受抑。MTT药敏测试发现转染了反义表达载体的SPC-A-1／CDDP细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、足叶乙苷和丝裂霉素6种化疗药物的耐药指数分别是3．87、3．28、6．71、2．65、2．11、5．02;对前五种化疗药物的耐药指数与对照细胞相比分别下降了2～3倍。表明该基因与肿瘤细胞的化疗敏感性密切相关。结论 该差异表达基因是一条肺癌耐药相关新基因,其在人类染色体的位置为19q13．3～19q13．4。     

ABCG_2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG_2的建立

目的 探讨腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG_2)在介导食管癌多药耐药中的作用.方法 扩增ABCG_2基因,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNNA3.1-ABCG_2重组质粒,转染Eca109细胞后用G418筛选稳定转染细胞.采用流式细胞术检测细胞内阿霉素的含量,评价细胞对药物的外排作用.MTT法检测阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞生长的抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC_(50))和细胞的耐药指数.采用Western blotting和RT-PCR法检测细胞中ABCG_2蛋白及mRNA的表达量.结果 成功建立转染ABCG_2基因的Eca109/ABCG_2细胞.Eca109/ABCG_2细胞中ABCG_2的mRNA和蛋白表达量升高.阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞的IC_(50)值分别为18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88μg/ml.Eca109/ABCG_2细胞对阿霉素的耐药指数为3.97,且外排阿霉素的作用增强.结论 Eca109/ABCG_2细胞具有ABCG_2的耐药表型,能够稳定表达ABCG_2蛋白,可作为研究ABCG_2介导的多药耐药相关机制的细胞模型.     

反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响

目的研究反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响,探讨其对肿瘤发展和转移的影响.方法以端粒酶逆转录酶组分hTERT cDNA为模板构建反义hTERT逆转录病毒表达载体,包装重组逆转录病毒后感染胃癌SGC7901细胞,用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGF-C及其受体Flt-4 mRNA表达水平的变化,免疫组化法检测VEGF-C、Flt-4蛋白表达.结果反义hTERT稳定转染后SGC7901细胞VEGF-C及其受体VEGFR-3（Flt-4） mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.结论反义hTERT可有效抑制胃癌细胞VEGF-C及其受体Flt-4的表达,阻断肿瘤血管和淋巴途径转移.     

三氧化二砷逆转乳腺癌细胞株MCF-7/ADM多药耐药的研究

目的探讨三氧化二砷（As2O3）体外逆转人乳腺癌细胞多药耐药性的作用及机制。方法采用MTT法检测As2O3的细胞毒作用和处理前后耐药细胞对化疗药物的敏感性,用流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度,通过RT-RCR检测MDR1基因的表达。结果 As2O3在0.25mg/L以下剂量时对MCF-7和MCF-7/ADM耐药细胞株的抑制率均小于15%,半数抑制率（IC50）分别为1.01m/L和1.28mg/L,无细胞毒剂量0.2mg/L的As2O3能部分逆转MCF-7/ADM细胞对阿霉素的耐药性。同时无细胞毒剂量0.2mg/L的As2O3能使MCF-7/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加,MDR1表达下降。结论 As2O3具有体外部分逆转人乳腺癌细胞多药耐药性的作用,可能与增加细胞内药物积累、下调MDR1表达有关。     

MG_7Ag在胃癌细胞系SGC7901及其耐药亚系中的表达及功能

探讨MG_7Ag在胃癌药敏细胞系SGC 790 1及其耐药亚系SGC 790 1/VCR 0 3、SGC 790 1/VCR 0 7、SGC 790 1/VCR 1 0中的表达及功能。采用免疫细胞化学方法及流式细胞仪观察MG7Ag在胃癌药敏细胞及其耐药细胞系的表达 ;用MTT法检测单克隆抗体MG7对药物敏感性的影响 ;以阿霉素作为荧光标记用流式细胞仪观察MG7对细胞内药物浓度的影响。结果表明 ,MG7Ag在耐药细胞系的表达较药敏细胞明显增加 ,且随耐药指数的增加呈逐渐增加的趋势 ;胃癌药敏细胞及其耐药细胞与MG7共同孵育后 ,对长春新碱的药物敏感性减低 ;MG7与耐药细胞共同孵育后 ,细胞内阿霉素的浓度减低。MG7Ag可能作为一个新的与胃癌耐药相关的分子 ,在维持胃癌耐药细胞系SGC 790 1/VCR的耐药表型中起重要作用     

外源性p27KIP1基因抑制SGC7901细胞的增殖

研究p27^KIP1基因对胃癌细胞的细胞周期及细胞增殖的影响。采用脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入胃癌细胞系SGC7901中，通过免疫屯迹分析以及RNA斑点杂交方法检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，细胞活力实验及软琼脂集落形成实验显示转染p27^KIP1基因对细胞增殖的作用；流式细胞仪观察目的的基因对该细胞的细胞周期的影响。结果显示，转染p27^KIP1的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27^KIP1的表达；细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制42％；转染p27^KIP1的SGC7901细胞的集落形成率较对照组明显减少（P＜0．01）；p27^KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数，由33．68％增加到69．29％（P＜0．01）。研究表明，p27^KIP1基因可抑制SGC7901细胞由G1期向S期过渡，从而抑制细胞增殖。     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病（CML）融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞,探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性,设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA,测序正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1通过电穿法转染至p815细胞中,应用G418筛选阳性细胞克隆,在含10％FCS的RPMI1640中常规培养,收集细胞进行RT－PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA,序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确,构建了重组真核表达载体,并用电穿孔法将其转染p815细胞,RT－PCR法检测到该细胞系有bcr-ablmRNA水平的表达。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.