基因差异表达的研究方法

基因差异表达的研究方法△潘美辉金虎林袁建刚强伯勤（中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室，北京，１００００５）ＡｂｓｔｒａｃｔＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅ...     

脾气虚证患者基因差异表达研究

目的：研究慢性胃炎脾气虚证的特征性基因差异表达谱。方法:慢性胃炎脾气虚证患者及健康志愿者各选4例，镜下取胃黏膜组织，提取总RNA，一一配对制作基因芯片，采用荧光比值、生物信息学、双侧t检验等方法比较分析；实时荧光定量PCR检测相关基因。结果:差异表达基因54条，72.2%下调；其中与营养物质代谢和免疫调节相关差异表达基因45条， 71.1%下调；差异基因中有4条基因P＜0.05，为显著差异表达基因；实时定量PCR检测差异基因5条，4条与芯片结果一致。结论:慢性胃炎脾气虚证具有特征性的基因差异表达图谱，主要表现为与营养物质代谢及免疫调节相关基因呈下调趋势。     

肝癌相关基因差异表达分析

为了研究肝癌发生和发展的分子机理，用cDNA Microarray技术比较肝癌(HCC)和癌旁组织（nonHCC)基因差异表达情况，并选择4个差异表达基因用RT－PCR验证。在1176个肿瘤相关基因中，491个在HCC中表达，345个在nonHCC中表达。HCC中表达上调的基因172个，表达下调的基因89个，RT－PCR结果与cDNA Microarray的结果基本一致。差异表达最多的基因是与细胞信号传导和细胞分裂相关的基因。肝癌中生长因子及其受体相关基因表达上调，Ras-Raf-MAPK信号传导途径活化，与细胞周期相关基因的异常表达加速了细胞分裂进程。所有这些变化与肝癌的发生和发展密切相关。     

良恶性乳腺肿瘤外周血基因差异表达研究

目的:利用基因表达谱数据,探讨良恶性乳腺肿瘤患者外周血基因表达变化。方法:从GEO 数据库中获取良性和恶性乳腺肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMCs)表达谱。GEO2R 在线工具筛选差异表达基因, DAVID 工具富集基因功能和通路。STRING 数据库构建差异表达基因蛋白产物相互作用的网络,筛选核心基因。结果:良恶性乳腺肿瘤分别筛选到563和237 个差异基因,乳腺癌差异基因涉及白细胞激活、血管生成等生物学过程以及白细胞跨内皮迁移信号通路。IL8、RHOB、ITGB1 等为关键基因。结论:良恶性乳腺肿瘤患者外周血基因表达模式存在明显差异,为将外周血作为替代材料应用于乳腺肿瘤的诊断及监测研究开辟了新思路。     

油酸型ARDS大鼠肺基因差异表达的研究

目的： 用全基因表达谱芯片技术研究油酸型急性呼吸窘迫综合征(ARDS）大鼠肺基因的差异表达并对其进行分析,以进一步阐明ARDS发病的分子机制。方法：采用雄性SD大鼠舌下静脉注射油酸制作ARDS模型,腹主动脉取血并进行血气分析,取肺组织,部分组织固定进行病理学观察,其余组织提取RNA,经逆转录合成掺入生物素标记的cDNA探针,然后与基因芯片（涵盖 27 044转录本,代表22 012个基因）杂交,扫描芯片荧光信号图像,用Sam3.0进行统计处理,用博奥生物分子功能注释系统V4.0进行功能分析。随机选择 3个差异表达基因,用荧光定量 RT-PCR验证。结果：血气分析和病理学观察确定造模成功。芯片检测结果显示,在ARDS大鼠肺组织中,表达上调1.5倍以上的基因有73个,下调1.5倍以上的基因有298个,其中代谢相关基因上调的有1个,下调的有29个;免疫相关基因上调的有3个,下调的有7个;信号转导相关基因上调的有2个,下调的有9个;神经相关的基因上调的有3个,下调的有3个。结论：油酸型ARDS大鼠肺组织中发生了许多基因差异表达,这些基因涉及代谢、免疫、信号转导和神经等方面的功能,为初步阐明ARDS的发病机制带来启示。     

MPTP诱导的褐鼠黑质基因差异表达的研究

本研究目的在于获取１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）诱导的褐鼠黑质差异表达的表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＭＰＴＰ腹腔注射建立褐鼠帕金森病模型，利用差别显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ ＰＣＲ）技术分析ＭＰＴＰ 处理褐鼠与正常褐鼠黑质基因差异表达的状况，并筛选差异表达基因片段。结果经ＤＤＲＴ－ＰＣＲ 筛选并通过反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交去除假阳性，最终获得２ 个差异表达基因片段。对其中一个片段进行克隆、测序和同源性比较发现，该片段为一个新的ＥＳＴ 序列，并且与胰岛素原样α肽具有同源性。本研究的结果提示，差异表达序列的分析有可能为研究ＭＰＴＰ诱导的褐鼠黑质变性的分子机理提供线索。     

重症肌无力患者免疫相关基因差异表达的基因芯片研究

目的:使用基因芯片技术研究重症肌无力(MG)患者外周血单个核细胞免疫相关基因的差异表达。方法:采用BIOSTAR Human-6-V3型人类全长基因cDNA表达谱芯片筛选30例初次发病MG患者差异表达的免疫相关基因,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者外周血IL-6、TNF-α的水平,对MG患者病情按许贤豪绝对评分法进行评分,并比较其临床意义。结果:158条差异表达免疫相关基因中,表达上调的基因76条(Ratio值2.0倍以上),表达下调的基因82条(Ratio值0.5倍以下),差异表达的免疫相关基因主要涉及细胞因子及其受体、趋化因子及其受体、细胞黏附分子、白细胞分化抗原、免疫转录调节分子、天然免疫分子等,细胞因子中IL-6、TNF-αmRNA表达水平显著上调,与MG患者血清IL-6、TNF-α水平检测结果一致,血清IL-6、TNF-α水平与MG临床绝对评分呈正相关。结论:人类全基因芯片技术可以快速、高通量筛选出MG患者差异表达的免疫相关基因,结果证实多个免疫基因参与了MG发病过程,为进一步阐明MG发病的免疫机制及治疗提供新的思路。     

基因差异表达筛选技术在神经干细胞研究中的应用

神经干细胞（neural stem cells,NSCs）具有自我更新、自我增殖和多向分化潜能,它的发现为人们深入研究中枢神经系统的发育、分化以及探索治疗神经系统疾病的新途径开辟了新的思路。研究证实,哺乳动物的胚胎和成体内均存在NSCs。在胚胎时期,神经干细胞存在于大脑皮质、纹状体、海马、嗅球、小脑、脊髓等区域;在成体NSCs存在于脑室带、     

中药“神经再生素”促神经生长过程中基因差异性表达的初步研究

为了探索中药“神经再生素”促神经生长过程中基因水平的变化。本实验采用 dd-PCR方法 ,从体外培养背根神经节细胞加药组和不加药组中获得两者的差异表达片段 ,并经反杂交筛选、克隆测序、DNA序列检索分析、Northern验证。结果表明 ,差异显示共获得 8个差异条带 ,一个为下调基因 ,其余为上调基因 ,其中 2个 c DNA序列与 RRAJ5 16 1基因 (增殖相关基因 )、AF196 3 15基因 (锌指样蛋白 DDP2 ) 10 0 %同源 ,2个 c DNA序列与 AK0 0 175 7基因、STA5 SRR基因 (t RNA合成酶 )部分同源。结论是中药“神经再生素”在促神经生长过程中 ,对神经元基因的选择性表达起着重要的调控作用。     

基于表达谱的可卡因精神成瘾脑区性与时程性分析

目的 探讨不同奖赏性脑区及不同用药时程下可卡因的精神成瘾机制及其成瘾过程是否具有脑区性和时程性差异.方法 从基因表达谱中提取随可卡因摄入量递增、在不同用药时程下6个脑区(NAc、AMG、LH、Septum、VTA和mPFC)表达水平发生改变的基因,进行功能与通路富集分析,研究可卡因成瘾在不同脑区及不同用药时程时的关联性与特异性.结果 通过对不同脑区与不同用药时程可卡因成瘾基因富集性分析结果进行比对,发现富集条目存在差异性.结论 可卡因精神成瘾存在脑区特异性与时程特异性.     

基于相对风险的肿瘤基因差异表达分析

目的寻找与肿瘤相关的基因诊疗中差异表达基因提取的方法。方法将基因表达谱数据进行预处理,采用相对风险方法筛选出差异表达基因特征子集,计算其样本间距离,然后对特征基因加权排序和过滤冗余基因,最后应用分类器对卵巢癌基因数据集进行分析,测试该方法的有效性。结果选取20维特征基因,进行分类测试,当特征基因为3～5、7和12～20维时,分类准确率可以达到100%,假阳性率可以达到0,表现出较好的可靠性,能够有效地将2个样本类型分开。结论经分类器测试证明,分类精度高,效果优于使用传统的基因差异表达分析方法。     

尿毒症免疫高敏患者外周血单个核细胞基因差异表达研究

目的:从基因水平探索外周血单个核细胞(PBMCs)在尿毒症患者免疫高敏发生中的作用机制。方法:选择群体抗体反应 (PRA) >85%的尿毒症患者30例为免疫高敏组;PRA(-)尿毒症患者为对照组,均采新鲜血液。用Ficoll技术分离单个核细胞,并采用一步法提取总RNA,同组RNA样品等量混合,荧光染料标记后,逆转录合成cDNA探针。采用高通量基因表达谱芯片(16,920点基因)进行芯片杂交,扫描后得到Cy3/Cy5图像文件,筛选出基因差异表达的结果。结果: 差异性表达基因877条,上调基因88条,下调基因789条。通过资料分析,对某些基因与免疫高敏发生机制的关系进行初步探讨。 结论:外周血单个核细胞在免疫高敏发生中的作用可能与自身抗原识别、B淋巴细胞分化增强、抗凋亡作用增强和免疫抑制药物的耐药机制有关。     

低剪应力作用下内皮细胞的基因差异表达

用含 4 0 96点的 c DNA芯片高通量、大范围、高效率地研究人脐静脉内皮细胞受剪应力 (4.2 0 dyne/cm2 ,2 h)作用后基因的表达情况 ,以期了解低剪应力短时间作用对脐静脉内皮细胞基因表达的影响。结果显示 :低剪应力作用内皮细胞后与未行剪应力处理的对照组比较 ,共有 10 8条基因 (5 3条基因表达增加 ,5 5条基因表达下降 )出现差异表达 ,约占芯片上基因总数的 0 .0 2 6 %。其中抑癌基因、与脂质代谢的有关基因明显上调 ,而与应激反应、细胞代谢的有关基因的表达则明显降低。本实验为寻找内皮细胞剪应力诱导表达的新基因提供了新的思路。     

低剪应力作用下内皮细胞的基因差异表达及雌激素的干预作用

用含4096点的eDNA芯片研究单纯低剪应力（4．20dyne／cm^2，2h）作用下或生理浓度17β-雌二醇孵育48h后再经相同条件的低剪应力作用后内皮细胞基因的差异表达。结果发现：与未行剪应力处理的对照组相比，单纯低剪应力组共有108条基因（53条基因表达增加，55条基因表达下降）出现差异表达，约占芯片上基因总数的2．6％。其中抑癌基因、与脂质代谢的有关基因明显上调，而与应激反应、细胞的代谢的有关基因的表达则明显降低。先用雌激素孵育再行低剪应力处理的内皮细胞与未经任何处理的对照组比较，共有384条基因（226条基因表达增加，158条基因表达下降）出现差异表达，约占芯片基因总数的9．4％。在表达上调的基因中其转录产物涉及PGI2合成、单核／巨噬细胞的吞噬作用等；在表达下调的基因中其转录产物涉及纤维蛋白原的降解、原癌基因产物的生成等。     

Lovastatin对肝癌HepG2细胞作用后基因差异表达的初步研究

目的： 用cDNA芯片观察lovastatin作用前后HepG2细胞的差异表达基因。 方法： 20 μmol/L的lovastatin作用于HepG2细胞18 h，各提取实验组与对照组细胞总RNA，用cDNA直接标记法制备探针，进行杂交，杂交信号经扫描后，用软件分析基因表达情况。应用RT-PCR验证部分差异表达基因。 结果： Lovastatin作用后表达上调的基因有30个，表达下调的基因有11个，涉及信号转导、肿瘤免疫、细胞周期等方面，RT-PCR结果符合基因芯片结果。 结论： 用基因芯片筛选出的lovastatin作用后的肝癌细胞差异表达基因为深入研究他汀类药物的抗肿瘤机制提供重要的理论依据。     

基于R语言子宫内膜癌脂代谢基因差异性分析及免疫组织化学验证

目的:探讨R语言在基因表达数据库中筛选子宫内膜癌相关的脂质代谢关键分子的可行性.方法:从基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中筛选子宫内膜癌测序集GSE56087,基于R语言进行基因差异性分析及信号通路分析,从结果中选取可能有意义的高表达基因并进行免疫组织化学验证.结果:通过基因差异...     

电泳分析基因差异片段的方法学研究

提高不同长度基因片段的分辨率是基因分析的关键问题，我们对电泳分辨基因差异片段的方法在制胶、染色及凝胶保存技术上进行了三个方面的改进，建立了＂凝胶干燥长期保存法＂，能客观反映实验结果，重复性好，对一些目前尚未认识的片段，留下了原始档案资料，供将来进一步分析；干燥胶片还可照像、投影、复印和激光扫描。     

不同肝缺血时限肝硬化及非肝硬化肝组织基因差异表达及其意义

目的探讨肝硬化和非肝硬化肝组织肝缺血不同时限基因差异表达，为合理掌握肝缺血安全时限提供理论依据。方法以正常肝组织为对照，将观测标本分为A（非肝硬化）、B（肝硬化）两组，每组按不同缺血时限（分别为15、30、45min）分为3个亚组。标本取材后立即置入冻存备测，应用4000点基因芯片分析不同缺血时限各组基因差异表达。结果肝缺血15min，非肝硬化组基因表达谱变化以调控内环境稳定的编码基因表达上调为主，而肝硬化组则出现了多个调亡相关基因的高表达。肝缺血30min，两组肝组织调亡相关基因表达均处高峰阶段，不同点在于：肝硬化组促调亡基因表达的数量和Ratio值均大于非肝硬化组；非肝硬化组同期有多个热休克蛋白家族成员编码基因和抗氧化蛋白编码基因高表达肝缺血45min，肝硬化组和热休克蛋白和抗氧化蛋白编码基因均处于低表达水平。结论肝脏遭受缺血性损伤后决定细胞生存状态的关键时限点大约在30min左右；非肝硬化组织抗损伤能力较强，有可能发生耐受超过30min甚至更长的肝缺血时限；肝硬化组织肝缺血安全时限以控制在30min以内为宜。参18。     

海洛因成瘾者体表胃电研究

海洛因成瘾者体表胃电研究     

海洛因成瘾者免疫功能的研究

对２２例海洛因成瘾者的免疫功能的研究发现，海洛因成瘾者的ＮＫ细胞毒活性ＩＬ－２活性，Ｔ细胞亚群的ＣＤ３和ＣＦ４细胞数量以及血清中ＩｇＡ和ＩｇＭ的含量，均比正常健康人对照组低，统计学处理后有显著性差异，表明海洛因成瘾者的免疫功能受到了抑制。