NRP-1在调控人舌鳞状细胞癌细胞分化中的作用

目的:构建神经纤毛素1(Neuropilin-1,NRP-1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对人舌鳞状细胞癌细胞株SCC25(squamous cell carcinoma 25)分化的影响。方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰NRP-1编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1。将构建正确的PL-KO.1/NRP-1-shRNA感染SCC25,western blot和实时荧光定量PCR检测NRP-1的表达,划痕实验和实时荧光定量PCR检测其对SCC25分化的影响。结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,SCC25转染了NRP-1-shRNA后NRP-1表达水平降低,干扰效率达65%。划痕实验结果表明NRP-1下调明显降低了SCC25的迁移能力。实时荧光定量PCR结果表明NRP-1下调可以导致SCC25上皮标记蛋白钙粘附蛋白(epi-thelial cadherin,E-cadherin)表达上调,而间充质标记蛋白纤粘蛋白(fibronectin,FN)和波形蛋白(Vimentin,VIM)表达下调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论:慢病毒介导的NRP-1-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响SCC25的分化。     

PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响

目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞(dental pulp st...     

慢病毒介导的Delta1-RNA干扰对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨Notch配体Delta1基因的特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)增殖及分化的影响.方法 利用Delta1-RNAi慢病毒载体感染体外培养的DPSC获得稳定的Delta1-RNAi DPSC系;实验分3组:经Delta1-RNAi慢病毒感染的DPSC组(慢病毒组),经空慢病毒感染的阴性对照组和正常细胞的正常对照组,采用细胞生长曲线测定( cell counting kit-8,CCK-8)、流式细胞仪及免疫组化等方法检测细胞生长曲线、细胞周期、细胞核增殖抗原表达的变化情况;对各组细胞进行体外成牙本质分化诱导,采用茜素红染色法检测钙化结节数量的差别,并用碱性磷酸酶(ALP)活性检测ALP及蛋白质印迹法检测诱导后各组细胞中牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达量的区别.结果 与正常对照及阴性对照组相比,慢病毒组DPSC增殖能力显著降低,其S期细胞比例及增殖指数分别由正常对照组的22.32±2.35和33.68 ±4.19显著降低至5.44±0.91和16.0 ±6.07(P ＜0.05),细胞核增殖抗原的表达显著下降;慢病毒组细胞经诱导后形成钙化结节数量明显增多,ALP及DSPP表达含量较正常对照组及阴性对照组显著增高.结论 Notch配体Delta1基因被干扰下调后,人DPSC的体外增殖受到抑制,在体外成牙本质诱导培养条件下,细胞向成牙本质细胞的分化加快,证明Notch-Delta1信号转导途径对人DPSC的自我更新及分化的调控起着重要作用,为牙髓损伤后修复提供了理论基础.     

E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6（Age I/EcoR I）质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。     

PERK干扰慢病毒载体的构建及其在人牙髓细胞中的表达

目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63％.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件.     

重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞

目的：构建重组转录因子hFOXA2 和hPDX1慢病毒载体,转染乳牙牙髓干细胞,诱导其向胰岛素生成样细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。方法：酶消化法分离培养人牙髓干细胞(DPSCs),有限稀释法纯化培养,流式细胞术分析细胞表面标志,并进行体外多向分化诱导验证;构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,Lipofectamine2000转染293T细胞进行病毒包装,通过荧光细胞计数测定病毒感染效率和滴度;以最佳感染复数(MOI)感染牙髓干细胞,诱导其体外重编程为胰岛素生成样细胞,免疫荧光染色测定PDX1、FOXA2及胰岛素原表达,ELISA法检测胰岛素分泌情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：体外成功分离培养人DPSCs;细胞表面表达STRO-1(98.01%)、CDl46(98.51%)、CD34(99.54%)和CD45(24.08%)。体外成骨、成软骨、成脂肪诱导分化特异性染色阳性;成功构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,双酶切和测序鉴定与GenBank的序列完全符合;病毒包装效率分别为(96.15±0.17)%和(95.49±0.21)%,感染滴度约为1.80×108 GTU/mL,最佳MOI为20;诱导后的细胞表达胰岛素原、FOXA2和PDX1,胰岛素分泌量为1.92 μmol/L,较未诱导组和对照组均显著增高(P<0.01)。结论：DPSCs经重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1转染诱导,可启动细胞重编程机制,形成胰岛素生成样细胞,可作为糖尿病基因治疗的种子细胞。     

DNMT1干扰对唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M E-cadherin表达的影响

目的：建立DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达稳定抑制的唾液腺腺样囊性癌细胞系ACC-M,探讨DNMT1表达抑制对ACC-M细胞E-cadherin表达的影响。方法：设计靶向干扰DNMT1的shRNA序列,构建携带该序列的慢病毒载体并转导ACC-M细胞,对筛选出的抗性克隆采用RT-PCR、荧光定量PCR、免疫印迹方法分别检测DNMT1mRNA、蛋白质水平,筛选获得DNMT1表达稳定抑制的ACC-M细胞,并通过甲基化特异性PCR检测E-cadherin基因启动子的甲基化状态,荧光定量PCR检测E-cadherin的表达情况。采用SPSS11.0软件包对数据进行t检验。结果：筛选获得DNMT1稳定表达抑制的ACC-M细胞,其mRNA、蛋白相对表达水平（0.156±0.008,0.163±0.013）显著低于空白对照组和空载对照组。进一步检测发现,E-cadherin基因启动子甲基化水平明显降低,E-cadherinmRNA表达水平显著增高,P〈0.05。结论：shRNA慢病毒载体介导的RNA干扰能够有效、稳定地抑制ACC-M细胞DNMT1的表达,并降低ACC-M细胞E-cadherin基因启动子的甲基化水平,从而使E-cadherin基因表达增强。     

慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的 人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

目的 通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的口腔黏膜上皮细胞（OMECs）,探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法 提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应（PCR）法扩 增hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗 性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测hTERT基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建了pLVX-puro-hTERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石 样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,hTERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学 意义（P<0.05）。结论 通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人 永生化OMECs细胞系奠定了实验基础。     

shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌细胞端粒酶卡侯体蛋白1基因的沉默效应

目的：探讨shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌Cal27细胞系端粒酶新蛋白,即端粒酶卡侯体蛋白1（TCAB1）基因的沉默效应,以期探索肿瘤基因治疗的新途径。方法：根据TCAB1基因,构建慢病毒shTCAB1-A~D,测定病毒滴度;用重组慢病毒体外感染Cal27细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达推断感染效率;半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TCAB1 mRNA水平;Western blot检测TCAB1蛋白质的表达水平;四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测细胞体外增殖能力;Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力改变。结果：经PCR与测序鉴定证实成功构建靶向TCAB1的慢病毒RNAi载体,病毒滴度为1.5×108~3×108 U·mL-1。荧光显微镜观察显示,绝大部分细胞表达绿色荧光。与空白细胞对照组相比,4种不同的shTCAB1-A~D慢病毒感染组TCAB1 mRNA表达下调48.7%~62.0%;蛋白抑制率达45.6%~77.5%,shTCAB1-C组最明显。shTCAB1-C慢病毒能明显抑制Cal27细胞增殖能力,也能降低其侵袭能力,穿过人工基底膜的平均细胞数明显低于空白对照组及非特异性对照组,侵袭抑制率高达67.5%（P〈0.05）。结论：成功构建并包装了端粒酶新蛋白TCAB1靶向的RNAi慢病毒,该病毒可高效感染人口腔鳞状细胞癌细胞,产生特异性的基因沉默效应。     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

p38β在矿化诱导液诱导的人牙髓细胞成牙本质向分化中的作用

目的研究p38β丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)对矿化诱导液诱导的人牙髓细胞(h DPC)成牙本质向分化的影响。方法体外培养hDPC,Western blot检测hDPC矿化诱导0、3、7、14 d后p38β蛋白表达情况;构建3条慢病毒载体p38β鄄shRNA并分别转染hDPC,Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p38β蛋白及基因表达;设立空白对照组、矿化诱导(OM)组、OM+空载体(NC)组、OM+sh鄄p38β组共4组。成牙本质向矿化诱导1、7、14 d,实时荧光定量PCR检测成牙本质向分化指标牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;Western blot检测成牙本质向分化指标DSPP蛋白的表达;成牙本质向矿化诱导14 d,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。结果 Western blot结果表明正常牙髓组织中存在p38β蛋白;成功构建p38β稳定低表达的hDPCs(实时荧光定量PCR显示三条序列干扰效率分别为55.4%、68.3%、54.2%);实时荧光定量PCR显示沉默p38β的hDPCs经矿化诱导后,成牙本质向分化指标DSPP、ALP基因表达水平显著降低,Western blot结果显示成牙本质向分化指标DSPP蛋白表达水平显著降低;茜素红染色结果显示,矿化诱导+sh鄄p38β组与空白对照组较另外两组的矿化结节数量明显减少。结论 p38β在OM诱导的h DPC成牙本质向分化中发挥作用。     

沉默整合素α6通过激活FOXO1信号通路促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化

目的:探讨沉默整合素α6(integrinα6,ITGA6)是否通过激活FOXO信号通路影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)的成牙本质向分化。方法:利用课题组前期构建的ITGA6沉默慢病毒干扰hDPSCs,通过Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,同时检测空载组(sh-NC)和ITGA6沉默组(sh-ITGA6)的FOXO信号通路活性。然后用AS1842856抑制FOXO1,经矿化诱导7 d后进行Western blot和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色来观察hDPSCs的成牙本质向分化情况。结果:Real-time PCR和Western blot结果显示构建的ITGA6沉默慢病毒能有效干扰hDPSCs中ITGA6的表达;与sh-NC组比,sh-ITGA6组FOXO1在mRNA水平表达上调(P<0.05),同时Western blot结果显示其在胞核表达量增加(P<0.05);Western blot检测成牙本质向分化标记物显示,sh-ITGA6组牙本质...     

BmaI1在经典Wnt通路调控间充质干细胞衰老中的作用

目的： 探讨Bmal1与Wnt经典信号通路对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的衰老是否具有协同或拮抗作用。方法： 分为转染组和空白对照组,转染组用Bmal1的慢病毒转染NIH-3T3细胞表达增强后,通过实时荧光定量PCR和Western免疫印迹等方法检测转染组和空白组β-catenin、TCF1表达量。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 经PCR鉴定,Bmal1基因重组慢病毒载体构建成功,转染Bmal1表达增强后,β-catenin表达也显著增强（P<0.05）,但与TCF1增强比例不同;而TCF1的变化无统计学意义。结论： Bmal1对Wnt 经典信号通路直接或间接调控小鼠 BMSCs 的增龄性改变具有协同作用。     

Wnt通路抑制剂XAV-939对牙髓干细胞成脂分化的影响

目的：通过体外实验探讨Wnt通路抑制剂XAV?939对牙髓干细胞增殖及成脂分化的影响。方法酶消化法培养牙髓干细胞,鉴定后采用CCK8试剂盒检测XAV?939对牙髓干细胞增殖的影响,油红O染色检测XAV?939对牙髓干细胞成脂分化的影响,qRT?PCR检测成脂分化过程中,XAV?939对Wnt通路相关基因糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase?3β, GSK3β）和β?catenin以及成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator activated receptor?γ2, PPARγ2）和CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）的影响。结果牙髓干细胞成脂诱导14 d后,XAV?939上调GSK3β、PPARγ2和C/EBPα的表达,同时下调β?catenin的表达。结论 XAV?939可以通过抑制Wnt通路促进牙髓干细胞的成脂分化。     

三维培养的牙髓干细胞参与牙髓损伤修复能力的实验研究

目的：将体外建立的细胞因子BMP-2作用下牙髓干细胞（DPSC）三维培养体系应用于大鼠牙髓损伤模型中,观察DPSC对牙髓组织损伤修复的能力。方法：已构建的三维培养DPSC的细胞团添加BMP-2体外持续培养7 d,BrdU标记及检测鉴定后,将其置于建立的大鼠牙髓损伤模型洞内,移植4周后HE染色,改良Mallory三色法染色观察,免疫组化检测BrdU标记的细胞分布。结果：移植后4周,DPSC三维细胞培养的牙髓盖髓实验中有骨样牙本质基质形成,没有观察到组织的炎症和坏死。在基质中可以看到骨性成牙本质样细胞,带有长的突起的成牙本质样细胞在骨性牙本质中形成管状牙本质。结论：损伤的牙髓表面植入添加BMP处理的DPSC细胞团能够产生修复性牙本质。     

牙髓干细胞、外胚间充质干细胞裸鼠体内分化的实验研究

目的：将免疫磁珠STRO＋-1的牙髓干细胞（DPSC）和外胚间充质干细胞（EMSC）与支架材料复合,观察在裸鼠体内移植后的分化能力,为干细胞分化能力研究提供依据.方法：收集免疫磁珠STRO＋-1的DPSC和EMSC,将其与陶瓷化骨复合移植入裸鼠背部皮下,8周后移植物组织学切片,HE染色观察及免疫组织化学检测DSP分布.结果：DPSC组移植物中可见新生基质,其相邻的结缔组织细胞部分出现极化,似成牙本质样细胞,局部放大可见类似于不典型的牙本质牙髓复合体.EMSC组有基质形成,结构不典型,有骨样基质形成,也存在有类牙本质牙髓复合体样结构.在移植后8周,DPSC组DSP在沉积的新生基质和部分出现极化的细胞胞浆中呈阳性表达.结论：通过免疫磁珠筛选的STRO＋-1的DPSC具有自我更新的特性,能够在体内继续分化形成牙本质样基质.EMSC组移植到裸鼠皮下,也能够形成基质.但是结构不典型.     

组蛋白去乙酰化酶8对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶8（histone deacetylase 8,HDAC8）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠 BMSCs,转染 HDAC8过表达慢病毒载体,并于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量PCR、Western blot检测BMSCs成骨分化能力的变化;矿化诱导14 d后,茜素红钙结节染色检测BMSCs矿化能力的变化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂---曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）刺激转染HDAC8过表达慢病毒载体的 BMSCs,于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量 PCR及 Western blot检测 TSA刺激前后过表达 HDAC8的BMSCs成骨分化能力的变化。结果：HDAC8过表达组经矿化诱导7 d 后,成骨分化相关基因 mRNA、蛋白表达水平均低于空白对照组;经14 d矿化诱导后,HDAC8过表达组茜素红钙结节的着色程度及范围低于空白对照组。TSA 刺激的 HDAC8过表达组矿化诱导7 d后,成骨分化相关基因 mRNA及蛋白的表达均高于未加刺激组（P＜0．05）。结论：HDAC8对大鼠 BMSCs成骨分化具有抑制作用。