E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体.方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(Age I/EcoR I)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确...     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

靶向细胞分裂周期蛋白6 RNAi慢病毒载体的构建

目的 探讨细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)RNAi慢病毒载体的构建.方法 设计5个靶向Cdc6的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4、5),构建靶向Cdc6的RNA干扰载体和Cdc6过表达载体,共转染293T细胞进行外源筛靶,采用Western blot检测Cdc6蛋白表达情况,判断不同靶点的干扰效果,选择两条最佳RNAi有效靶点序列,制备靶向Cdc6的慢病毒载体,并将其转染Tca8113细胞,通过Real-time RT-PCR和Western blot检测Cdc6 mRNA和蛋白表达水平,以MTT法测定Tca8113细胞生长水平.结果 成功构建Cdc6 siRNA表达质粒及Cdc6过表达载体质粒,经外源筛靶实验显示,相对阴性对照组(NC),Target 3和Target 4靶点对Cdc6蛋白表达的敲减作用最显著,敲减率分别为69.15%和84.85%.在Tca8113细胞中,与NC组比较,靶向Cdc6慢病毒载体KD1和KD2组Cdc6 mRNA表达的敲减率分别为50%和65%:Cdc6蛋白表达水平分别下降65.87%和79.38%;Tca8113细胞生长抑制率分别为25.84%和30.34%.结论 成功构建两条靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体:Target 3和Target 4.     

慢病毒表达载体pLentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人骨形成蛋白2(hBMP2)及神经生长因子(hNGF)目的基因的慢病毒载体.方法:使用限制性内切酶,将新霉素抗性基因(Neo)从载体pLentiTrident1-EGFP-Neo切下,插入pLentiTrident1空载体的相应多克隆位点上.构建出含新霉素抗性的表达载体.采用PCR扩增得到hBMP2与hNGF的目的片段,通过多克隆位点将2个目的基因插入表达载体.对该重组载体进行酶切鉴定、PCR鉴定以及DNA序列测序分析.结果:通过酶切鉴定及测序分析,慢病毒表达载体(plentiTrident1-hBMP2-Neo-hNGF)构建成功.结论:成功构建了hBMP2与hNGF的共表达慢病毒载体.为研究神经因素在骨组织再生中的作用奠定了基础.     

Naa10基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对口腔鳞癌细胞生长的影响

目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×10⁹ TU/mL和1.0×10⁹ TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。     

cbfa1、satb2双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体。方法:采用PCR技术,从质粒中扩增基因cbfa1和satb2,经TA克隆、酶切筛选后,对阳性重组子进行商业测序鉴定。将测序正确的cbfa1和satb2分别插入pIRES上、下游的相应酶切位点中,构建pIRES-cbfa1-satb2。然后通过双酶切,得到cbfa1-Ires-satb2片段,将其插到含有neo/kana基因的慢病毒载体pLentinTrident1-CMV的相应酶切位点上,构建慢病毒真核表达载体pLentinTrident1-CMV-cbfa1-Ires-satb2。结果:通过PCR技术成功扩增了cbfa1和satb2基因,借助中间载体pIRES中的内部核糖体进入位点,将cbfa1和satb2同时连到了慢病毒载体pLentinTrident1-CMV上,经PCR、酶切及测序验证,质粒构建成功。结论:本实验成功构建了携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体,为进一步研究2种基因的功能奠定了基础。     

BimS慢病毒RNA干扰载体的构建及其感染效率和干扰效果的实验研究

目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果.方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体中.将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果.结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符.重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10s TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85％.转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P＜0.05).结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达.     

颌骨骨肉瘤中E2F-1表达及意义

目的：分析Ｅ２Ｆ－１在颌骨骨肉瘤中的表达及意义。方法：利用免疫组化ＡＢＣ法检测Ｅ２Ｆ－１在２０例颌骨骨肉瘤和８例骨软骨瘤中的表达。结果：骨肉瘤中Ｅ２Ｆ－１的阳性表达率为７０％（１４／２０）,Ｅ２Ｆ－１表达在各病理分型间无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,转移与未转移病例Ｅ２Ｆ－１的表达无显著性差异（Ｐ〉０．０５）;而骨软骨瘤中无Ｅ２Ｆ－１的表达（０／８）,与骨肉瘤相比有显著性差异（Ｐ〈０．０５）。结论：     

microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

PERK干扰慢病毒载体的构建及其在人牙髓细胞中的表达

目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63％.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件.     

E2F-1基因沉默对舌鳞癌细胞环氧化酶-2基因表达影响的研究

[摘要] 目的 探讨核转录因子E2F-1基因沉默对舌鳞癌细胞环氧化酶-2(COX-2)基因表达的影响。方法 体外合成靶向E2F-1基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,克隆到pLKO.1-PURO-U6(Age I/EcoR I)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。将病毒载体转染舌鳞癌细胞Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western-blot检测E2F-1和COX-2基因的表达。结果经酶切和测序证明,靶向E2F-1基因的shRNA序列正确;转染组E2F-1和COX-2基因mRNA和蛋白表达均发生明显下调,与空白对照组相比,差异有统计学意义,阴性对照组未见明显差异。结论 靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体可特异性沉默E2F-1基因的表达;E2F-1基因沉默后可下调COX-2基因表达。     

pEGFP—N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的：构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法：利用RT—PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T—Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP—N1真核表达载体连接,构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP—N1及pEGFP—N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT．PCR检测Snail在该细胞中表达。结果：本实验成功构建了pEGFP—N1—Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论：本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。     

NS-398诱导舌鳞癌细胞凋亡及其对E2F-1蛋白表达的影响

目的观察选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂NS-398诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡及其对细胞核转录因子E2F-1蛋白表达的影响。方法NS-398作用于舌癌Tca8113细胞,噻唑蓝法检测细胞生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期及其凋亡率的改变,放射免疫法测定细胞上清液中前列腺素E2(PGE2)含量,Western blot法检测细胞中COX-2和E2F-1蛋白表达的变化。结果NS-398可以抑制Tca8113细胞的增殖,其抑制作用随着时间的延长和药物浓度的增加而增强。NS-398(50μmol/L)可引起Tca8113细胞G0/G1期细胞的逐渐增加,S期和G2/M期细胞比例数减少,并随着时间的延长细胞上清液中PGE2含量降低,细胞中COX-2和E2F-1蛋白表达下调。结论NS-398可以抑制Tca8113细胞的增殖,阻断细胞生长停滞于G0/G1期;该效应可能与其诱导细胞凋亡和降低细胞产生前列腺素E2有关;E2F-1蛋白可能参与了这些过程。