快速蛋白液相色谱系统纯化肺癌组织热休克蛋白70及其鉴定

目的:从肺癌组织中纯化并鉴定热休克蛋白70(HSP70),为研究其免疫原性和作为肿瘤疫苗奠定基础.方法:用组织蛋白裂解液从肺癌组织中提取总蛋白,应用ConA-sepharose亲和层析和快速蛋白液相色谱系统(FRLC)连续分离、梯度洗脱获得蛋白,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot进行蛋白相对分子质量及免疫原性鉴定.结果与结论:所获蛋白的相对分子质量为70 000,经Western-blot鉴定为HSP70.     

二磷酸腺苷琼脂糖亲和层析法纯化HSP70多肽复合物

采用二磷酸腺苷（ADP）琼脂糖亲和层析的方法，从小鼠肝脏或肿瘤组织中纯化热休克蛋白（HSP）70多肽复合物。用Western blot和硝酸银染色对所纯化的蛋白质进行鉴定，表明纯化的蛋白质为均一的HSP70。为了证实纯化的HSP70是否为HSP70多肽复合物，将此纯化物与10mmol/L ATP,3mmol/L MgCl2,0.5mmol/L CaCl2孵育后，用centricon 10滤过并收集小分子片段，经反向高压液相色谱分析，发现在215nm和220nm有很多吸收峰，证明此HSP70为HSP70多肽复合物。一般情况下，采用ADP琼脂糖亲和层析方法1g组织可以获得120μg HSP70多肽复合物。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

人肺腺癌A549细胞株中HSP70多肽复合物的分离与纯化

目的:探讨肺腺癌细胞中热休克蛋白70多肽复合物分离及纯化的方法.方法:采用裂解液裂解、超声破碎、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析方法,从体外培养的热休克(43℃)处理后的人肺腺癌细胞株A549中分离纯化HSP70多肽复合物,通过SDS-PAGE电泳、Western-blot检测获得蛋白.结果:获得蛋白的相对分子质量约为70 000,能与抗HSP70特异单抗结合.结论:采用ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析从肺腺癌细胞株A549中可获得高纯度的HSP70多肽复合物,为进一步研究以HSP70多肽复合物为基础的肺癌免疫治疗提供了依据.     

快速蛋白液相色谱系统纯化和分析小鼠肝癌细胞热休克蛋白70例的研究

目的：应用快速蛋白液相色谱（FRLC）系统建立分离和纯化615系小鼠肝癌细胞Hcaf细胞膜上热休克蛋白（HSP70）的分离方法。方法：用经43℃热处理8h的Hcaf细胞制备裂解液,用ConA-Sepharose4B和MonoQ柱进行连续分离,所得蛋白经电泳及Western-blot进行蛋白分子量及性质鉴定。结果：纯化蛋白经鉴定分子量70000的HSP70。结论：用此层析法经FRLP可分离纯度较高的HSP70。     

前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70羧基端结构域的融合表达及纯化

目的构建前列腺干细胞抗原fprostatestemcellantigen,PSCA）及热休克蛋白70（heat-shockprotein,HSP70）羧基端结构域的重组表达质粒,对重组融合蛋白进行诱导、表达及纯化,为肿瘤疫苗的研究奠定基础。方法克隆人HSP70羧基端基因及PSCA基因,构建重组表达载体pET21一PSCA-HSPC,重组融合蛋白经（isopropyl-B-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达,利用单克隆抗体进行Westernblot鉴定,最后进行蛋白纯化。结果成功构建了重组表达质粒pET21-PSCA-HSPC;SDS-PAGE结果显示目的蛋白以可溶性形式存在,经镍柱亲和层析、苯基柱疏水及凝胶过滤柱纯化后,重组融合蛋白纯度在95％以上。结论该研究成功实现了PSCA与HSP70羧基端结构域的可溶性表达。     

人热休克蛋白70D的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的：研究热休克蛋白70D(heat shock protein 70D，HSP70D)的基因克隆、重组表达及纯化。方法：采用RT-PCR方法从HeLa细胞中克隆HSP70D全长编码区cDNA序列，构建原核表达载体pET24a（ ）-HSP70D，经过DNA序列测定证实共序列正确。完成基因工程人HSP70D的高表达工程菌的筛选后，对其发酵、蛋白表达条件及重组蛋白的纯化条件进行优化。结果：重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果相符，高表达工程菌经优化表达条件后rhHSP70D的表达量可占菌体总蛋白的20％以上。经过低浓度乙醇沉淀、DEAE阴离子交换、疏水柱层及S200凝胶过滤柱后，获得了纯度大于95％的rhHSP70D。结论：本研究为进一步开展以HSP70D为基础的肿瘤免疫治疗研究提供了实验基础。     

小鼠肺腺癌热休克蛋白70-抗原肽复合物的纯化

目的　探索肿瘤热休克蛋白 70抗原肽复合物 (HCA70 )分离、纯化的方法。方法　采用低渗、反复冻融匀浆、ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析 ,从体外培养的小鼠肺腺癌细胞 (LA - 795)中纯化HAC70 ;通过SDS -PAGE电泳、Westernblot检测、小鼠移植瘤动物实验证实所获得蛋白是否为HAC70。结果　获得蛋白分子量为 70kD左右 ,与抗HSP70特异单抗结合 ,用此蛋白主动免疫的小鼠可抵抗LA795细胞的攻击 ,获得了高纯度的HAC70。结论　采用ADP -Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析可获得高纯度的HAC70。     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

HEREDITARY PROTEIN S DEFICIENCY——SURVEY OF A CHINESE FAMILY

A 76-year-old woman was diagnosed as having left lilac deep vein thrombosis due to a hereditary deficiency of protein S, seventeen members of her family were studied with the measurements of total protein S (TPS), free protein S (FPS), protein C (PC) and anti-thrombin-Ⅲ(AT-Ⅲ). The results showed that the level of FPS of thepatient was only 7%, while that of TPS 137.1%. Her secondson had a low FPS level (13.4%) too, and his TPS level was 48.1%. PC and AT-Ⅲwere all normal It was thus the first case of hereditary PS dificiency reported in China.     

Akt的PH结构域与其调节区的结合

目的 从人T细胞中克隆Akt的PH结构域及其调节区基因并进行6-his和GST融合表达，研究二者的体外结合情况，为进一步研究Akt的调节区在其分子激活中的作用打下基础。方法 以RT-PCR的方法从人T细胞中扩增目的基因片段，测序证明序列正确，再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pRSET-A和pGEX-4T-1中，以IPTG诱导，获得Akt的PH结构域及其调节区与6-his和GST的融合表达。表达的PH结构域融合蛋白经谷胱甘肽耦联的琼脂糖珠纯化，以pull-down法检测该PH结构域与6-his调节区的结合。结果 Akt的PH结构域和调节区基因序列完全正确。得到与GST和6-his的融合表达，表达产物有较高可溶性。结论 SDS-PAGE检测到PH结构域可在体外与调节区特异地结合。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

Survivin、Her-2、P16和PTEN在膀胱癌中的表达及意义

目的研究Survivin、Her2、P16和PTEN蛋白在膀胱癌中的表达及其生物学意义。方法采用免疫组织化学SP法检测43例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱组织中以上4种蛋白的表达。结果4种蛋白在膀胱癌中的表达与在正常膀胱黏膜比较差异均有显著性意义(均为P<0.01)。不同临床分期间Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05);不同病理分级间Survivin、Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。Her2和Survivin蛋白表达间存在正相关(r=0.821,P<0.05)。结论Her2和Survivin的高表达是膀胱癌预后不良的指征;P16可作为早期诊断的标记物;PTEN则可作为膀胱癌预后不良的独立性指标。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

骨肉瘤p16与Rb蛋白的表达及其相关性的研究

目的 检测ｐ１６和Ｒｂ蛋白在骨肉瘤中的存在情况，以探讨骨肉瘤中ｐ１６和Ｒｂ蛋白的表达及其相关性。方法 采用免疫组化ＡＢＣ法对３２例骨肉瘤手术标本使用抗ｐ１６和Ｒｂ蛋白抗体进行检测。结果 ｐ１６和Ｒｂ蛋白阳性表达分别为３７．５％（１２／３２）和５６．３％（１８／３２）；在１２例Ｒｂ蛋白阳性或强阳性表达的骨肉瘤中，ｐ１６蛋白表达缺失或弱阳性表达８例（６７％）；相反，在１０例Ｒｂ蛋白阴性或弱阳性表达中，     

肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及意义

目的　探讨肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及其与临床病理因素的关系。方法　应用免疫组织化学S P法检测 6 2例肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达。结果　肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达阳性率分别为 5 3.2 %和6 4 .5 % ,PCNA蛋白表达阳性肺癌Fhit蛋白阳性率明显低于PCNA蛋白表达阴性肺癌 (P <0 .0 1)。Fhit蛋白和PCNA蛋白在肺癌中表达与肺癌的分化程度、淋巴结转移、3年生存期均密切相关 ,PCNA蛋白与肺癌病理类型亦有关。结论　Fhit蛋白和PC NA蛋白异常表达与肺癌发生、发展密切相关 ,二者相互抑制 ,呈明显负相关     

非小细胞肺癌患者肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白的表达及其临床意义

目的 检测肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况.并探讨其临床意义.方法 采用免疫组化方法对术前未经化疗、术后病理诊断明确的92例肺癌组织标本并以20常肺组织作为对照进行了多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）表达的检测.并对病理类型、分化程度、临床分期、预后等进行统计学分析.结果 （1）92例肺癌组织中MRP、LRP及其两者共表达的阳性率分别为53%、52%和45%,均显著高于正常肺组织中的表达水平（P〈0.05）.（2）MRP、LRP蛋白表达在不同病理类型、不同分化程度之间具有统计学差异（P〈0.05）,而在不同年龄、性别、临床分期、淋巴结转移情况等均无明显差异.另外,MRP、LRP蛋白的表达与患者预后密切相关,且随着耐药蛋白表达种类的增加,生存曲线水平下降.结论 NSCLC中MRP、LRP的表达可能在肺癌的原发性多药耐药中起不同程度的作用,检测NSCLC中MRP、LRP在判断患者预后.指导肿瘤化疗方面具有重要的临床意义.     

树舌多糖对HepA小鼠瘤细胞蛋白质表达影响的研究

目的探讨树舌多糖抗肿瘤的作用机制,寻找特异蛋白。方法将各组小鼠的眼血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白分别做PAGE电泳,分析其蛋白组分的变化。结果树舌多糖作用后血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白的蛋白组分都有变化。