婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建(英文)

目的构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶靶向性基因治疗系统。方法 PCR 扩增 CD 基因,EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ对 CD 基因和 pGEX-1LamdaT 质粒同时进行双酶切,获得4.9 kb、1.3 kh 两个 DNA 片段。T4 DNA 连接酶连接这两个片段构建重组的CD/pGEX-1LamdaT 质粒,然后用电穿孔法将重组质粒转染婴儿双歧杆菌。从阳性转染的婴儿双歧杆菌中提取重组质粒,双酶切后检测切取片段长度,采用 Sanger 双脱氧链终止法对提取的重组质粒中的插入片段进行测序。结果从阳性转染的婴儿双歧杆菌中获得了6.2 kb大小的重组质粒,该质粒经双酶切后,得到了4.9 kb 和1.3 kb 两个长度的片段,其长度分别与 pGEX-1LambdaT 及 CD 基因的长度相同。测序结果显示,提取的重组质粒中插入的基因片段全长及核苷酸序列与 CD 基因完全相同。结论外源性 CD 基因被准确插入 pGEX-1LambdaT 质粒并转入婴儿双歧杆菌中,婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶靶向性基因治疗系统被成功构建。     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．     

MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建及在小鼠黑色素瘤细胞内的表达

目的:构建MAGE-1(melanomaantigen1)与人HSP70(heatshockprotein70)融合基因的真核表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70,并观察在小鼠黑色素瘤细胞内的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:HSP70基因经酶切后连入真核表达载体PIRES2-EGFP,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入PIRES2-EGFP-HSP70中HSP70基因的5'端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70。结果:扩增了MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70真核表达载体。结论:成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70,并在小鼠黑色素瘤细胞系稳定表达,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究

目的构建PML-RARα融合基因与人白介素-2（hIL-2）基因真核双表达质粒。方法利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点（MCS）A和B中,构建真核双表达质粒。利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、ELISA检测目的蛋白的表达情况。结果Nhe I／Mlu I和Sal I／Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARa基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML—RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录。经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白。结论成功构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML-RARα和hIL-2蛋白。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

编码反义人端粒酶RNA组分重组逆转录病毒载体的构建

目的:构建编码反叉人端粒酶RNA组分的重组逆转录病毒栽体,以用于肿瘤的基因治疗.方法:用PCR方法获得目的基因一人端粒酶RNA组分(hTERC),酶切分析及DNA测序进行鉴定,用T4连接酶连接酶切产物,PCR以及EcoR1和BamH1双酶切鉴定重组逆转录病毒载体.结果:hTERC大小为490 bp.DNA测序表明,pMD-hTERC中插入的hTERC与NCBI上的序列进行比对,同源性达到99%.重组逆转录病毒载体PLXSN-hTERC经ECORl和BamH1双酶切后,可见到大小分别为5 900 bp和500 bp的两条带.结论:编码反义人端粒酶RNA组分的重组逆转录病毒载体已构建成功,是一个很有前景的抗肿瘤治疗策略.     

靶向人Pokemon基因的shRNA重组质粒的构建

目的构建靶向Pokemon基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,为研究Pokemon基因在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法利用基因重组技术,依据siRNA的设计原则,针对目的基因的mRNA序列筛选了3对siRNA序列以及一对阴性对照序列,将其分别插入真核表达载体psiRNA-hHlneo H1启动子下游,经α互补筛选、酶切和DNA测序鉴定,构建靶向Pokemon基因的RNAi真核表达载体。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示siRNA片断正确,与设计序列一致,且成功插入预定位点。结论靶向Pokemon基因的shRNA重组质粒成功构建,为进一步研究Pokemon基因在多种疾病中的作用以及探索肿瘤的基因治疗奠定基础。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体的构建及鉴定

目的:构建4ARE强化的红、绿双荧光蛋白报告基因载体。方法:人工合成3对ARE序列，经退火和磷酸化后插入pARE-TK-GFP载体，构建成p4ARE-TK-GFP载体。以质粒pDsRed2-N1为模板，PCR扩增红色荧光蛋白及其启动子序列与pMD18-T载体连接，构建成pMD-DsRed载体。用Ade I酶和BspT I酶对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP进行双酶切，连接产物转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞后，挑取阳性克隆子进行质粒抽提酶切及测序鉴定。结果:经酶切及DNA测序证实，目的片段ARE及DsRed的序列完全正确，重组双荧光蛋白报告基因载体成功转入DH5α。结论:成功构建4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体并在DH5α内表达，为进一步研究ARE的调控作用奠定了基础。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Management of intracranial metastases of differentiated carcinoma of thyroid

Summary Brain metastases in differentiated carinoma of the thyroid is a rare occurrence. We treated five documented cases of carcinoma of thyroid with brain metastases out of 400 cases of thyroid cancer treated between 1972 to 1993. 4 were females out of which one was pregnant during the appearance of brain metastases. All cases were treated with thyroidectomy, and radioiodine as primary therapy. Brain metastases developed 6 months to 11 years following treatment of the primary and were treated with radiotherapy and suppressive levothyroxine. We observed the beneficial effect of suppressive thyroxine and the poor prognosis associated with pregnancy and withdrawl of thyroid replacement therapy. 3 of the 5 patients are alive 12–23 months after treatment for brain metastases, while 2 patients died at 4 months and 7 years post brain metastases due to pulmonary and hepatic failure, respectively.     

Clinico-Pathological Study of 50 Cases of Tumours of Larynx

Otoacoustic emissions have been advocated in the management of otitis media with effusion. However, otoacoustic emissions cannot differentiate different types of hearing loss. This study was conducted to find factor that can differentiate otitis media with effusion from other common causes of hearing loss in children. Children were enrolled in the study and divided in four groups consisting of 25 ears each after pure tone and impedance audiometry: (1) Otitis media with effusion group, (2) Normal ear group, (3) Sensory-neural hearing loss group, (4) Chronic suppurative otitis media group. Otoacoustic emissions were recorded and results were analyzed statistically. The normal hearing group had significant difference from other groups but total band reproducibility of transient evoked otoacoustic emissions did not show any statistical difference in the cases groups. In distortion product otoacoustic emissions, group 1 showed significant difference from group 3 and group 1 had significant difference from all other groups at 4 kHz. The study did not find any factor that differentiates otitis media with effusion from other diseases. Although, distortion product otoacoustic emissions can indicate otitis media with effusion but impedance audiometry should be the main tool in the management of otitis media with effusion.     

乳腺叶状囊肉瘤320例诊治分析

目的探讨乳腺叶状囊肉瘤临床诊断和治疗方法。方法回顾分析经手术病理确诊为乳腺叶状囊肉瘤的320例患者的诊断和治疗情况。结果行乳腺X片检查121例,B超检查25例,近红外检查21例,针吸细胞学检查42例;15例(12.4%)乳腺X片检查及3例(14.3%)近红外检查诊断为乳腺叶状囊肉瘤。临床诊断正确率为17.5%(56/320),误诊率为82.5%(264/320)。随访253例患者,其中局部复发45例(17.8%),远处转移死亡13例(5.1%)。结论乳腺叶状囊肉瘤诊断需常规病理检查,治疗宜行局部广泛切除或全乳切除。     

胆囊腺瘤癌变的相关因素分析

目的:探讨胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性。方法:应用ROC曲线,计算胆囊腺瘤癌变的肿瘤大小临界值。应用χ2独立性检验,计算胆囊腺瘤癌变与临床因素的相关性、临床表现与肿瘤位置的相关性。结果:肿瘤良恶性临界值为2.27 cm。胆囊腺瘤癌变与患者的性别、年龄、是否合并结石无明显相关性（P＞0.05）,而与肿瘤大小、肿瘤数目、形态、超声下是否有血流(P＜0.05)等临床病理特征有明显相关性。临床症状与肿瘤是否位于胆囊颈部有明显相关性(P＜0.05)。结论:胆囊腺瘤在超声扫描下表现为单发、无蒂、有血流、直径大于2.27 cm,应高度怀疑已有恶变。肿瘤位于胆囊颈部可引起右上腹胀痛、疼痛向右背部放射、恶心呕吐等临床表现。