P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox的变化

目的：探讨诱导P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox水平的变化。方法：P19细胞经0.9%二甲基亚砜（DMSO）于细菌培养皿中悬浮诱导培养4 d,待细胞聚集体形成,吸取聚集体接种于组织培养皿,贴壁培养至第13天。行Western blot检测肌钙蛋白I（cTnI）,以鉴定心肌样细胞的分化,并检测P19细胞向心肌样细胞分化前后细胞中gp91-phox蛋白水平。结果：（1）经0.9%DMSO诱导分化,P19细胞于第7天开始表达cTnI,随后cTnI表达明显增高并趋于稳定;（2）P19细胞分化为心肌样细胞后细胞内gp91-phox蛋白水平较分化前高（P〈0.05）。结论：P19细胞向心肌样细胞分化后gp91-phox表达上调,氧化应激水平增加。     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

心肌肌球特定基因-肌球蛋白轻链基因可在人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞表达

目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(p MLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(h UCMSC)向心肌样细胞分化中的表达。方法:酶消化法原代分离培养h UCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染p MLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(p MLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察p MLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞"兴奋-收缩"偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞p MLC2v蛋白的表达。结果:原代培养的P3 h UCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99%以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC同时并转染p MLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞p MLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;p MLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长p MLC2v蛋白表达明显增加(P0.05)。结论:在h UCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,p MLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据。     

桥粒芯胶蛋白-2基因沉默对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的 探讨在P19细胞诱导分化成心肌细胞过程中,桥粒芯胶蛋白-2（DSC2）基因沉默对其的影响。方法 设计并合成针对DSC2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染P19细胞。荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测DSC2在mRNA和蛋白水平表达变化,筛选出沉默效率最佳的细胞株。二甲基亚矾诱导分化为心肌细胞,观察其超微结构和细胞凋亡等改变,以及对纤维化与脂肪化相关基因mRNA水平表达的影响。结果 成功构建了5种ShDSC2重组质粒,转染P19细胞并获得稳定转染细胞株,筛选出对DSC2基因mRNA水平（69. 47% vs 0,P〈0. 01）和蛋白水平表达（65. 62% vs 0,P〈0. 01）的抑制效率最显著的ShDSC2鄄613组,并成功诱导分化为心肌样细胞后,电镜扫描显示后者细胞出现脂滴、空泡样变性、线粒体肿胀及嵴消失,流式细胞仪检测提示细胞凋亡显著增加,RT鄄PCR示纤维化相关基因（Collal、Colla2、Col3a1）与脂肪化相关基因（Adiponectin、PPAR-γ、C/EBP-α）的mRNA表达均显著升高。结论 建立能有效抑制DSC2表达的P19细胞株并分化为心肌样细胞,表现出与致心律失常型右室心肌病（ARVC）患者病理和分子生物学特点相似的表型特征,提示其可作为深入研究ARVC致病机制的前体细胞。     

类胚体形成对P19细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨类胚体(EBs)形成以及心肌细胞条件培养液对P19细胞向心肌细胞分化的影响。方法将P19细胞接种于铺有琼脂的6孔板中,形成EBs。用α-MEM培养液或心肌细胞条件培养液培养EBs或单层生长的P19细胞。观察细胞生长情况;免疫组化SP法检测心肌肌钙蛋白(cTnT)表达;Western blot法检测cTnT及心肌细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达。结果单层培养的P19细胞未见cTnT及Cx43表达,免疫组化SP法检测示EBs经α-MEM培养液或心肌细胞条件培养液培养,生长晕中可见cTnT表达。Western blot法检测示心肌细胞条件培养液中cTnT和Cx43表达显著高于α-MEM培养液。结论 EBs形成结合心肌细胞条件培养液培养可有效促进P19细胞向心肌细胞分化,具体分化机制有待深入研究。     

MiR-375抑制的人诱导多能干细胞分化为起搏样细胞的研究

目的 探讨抑制miR-375表达能否使其修饰的人诱导多潜能干细胞(hiPSC)在向hiPSC源性心肌细胞(hiP-SC-CMs)分化的过程中更高效地向起搏样细胞转化.方法 采用hiPSC时序性激活或抑制Wnt信号通路定向诱导分化到hiPSC-CMs,流式分析检测其分化效率.分别转染携带miR-375抑制剂和绿色荧光蛋白...     

绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系的建立及向心肌细胞分化

目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent prote in,GFP）的小鼠胚胎干细胞系,并诱导其向心肌细胞分化。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染小鼠胚胎干细胞,经G418筛选后选取GFP强阳性克隆进行扩增建系。对稳定表达GFP的胚胎干细胞系进行畸胎瘤形成检测,观察其多向分化潜能。诱导GFP阳性胚胎干细胞向心肌细胞分化。免疫荧光及RT-PCR检测心肌细胞特异性标志物。结果转染后胚胎干细胞经20次传代后仍然表达GFP,裸鼠皮下接种胚胎干细胞后3050 d均可形成畸胎瘤。GFP阳性胚胎干细胞成功向心肌细胞分化。结论成功建立表达GFP的小鼠胚胎干细胞系,并可诱导其向心肌细胞分化。     

溶血磷脂酸对胚胎干细胞分化心肌细胞L型钙通道电流的影响

目的诱导小鼠胚胎干(ES)细胞向心肌细胞分化并观察溶血磷脂酸(LPA)对分化心肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。方法采用悬滴培养法诱导小鼠ES细胞向心肌细胞分化,逆转录-聚合酶链式反应及免疫荧光检测心肌细胞特异性标志物,全细胞膜片钳记录LPA0.1,1.0和10μmol/L对小鼠ES细胞分化心肌细胞ICa-L的影响。结果小鼠ES细胞成功向心肌细胞分化。0.1,1.0和10.0μmol/LLPA使分化心肌细胞ICa-L峰电流密度分别由用药前-6.8±0.7pA/pF增加到-8.9±1.2,-12.6±2.9和-16.6±3.5pA/pF(P<0.01或P<0.05)。结论LPA呈浓度依赖性促进小鼠ES细胞分化的心肌细胞ICa-L。     

微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞表型分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSC)在非接触共培养的微环境中向心肌细胞分化的能力.方法 密度梯度离心法分离培养hBMSC,用流式细胞仪鉴别其表面标记特征.采用transwell按1:10的比例共同培养hBMSC和SD乳鼠心室肌细胞.用聚合酶链反应检测心肌转录因子GATA4的基因表达水平.免疫细胞化学、免疫荧光检测横纹肌α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌钙蛋白(cTn)T和cTnI等心肌细胞标志蛋白的表达.结果 hBMSC的标志物主要为CD29(98.64%±0.80%)和CD44(96.70%±1.50%),而极少表达CD105(2.21%±0.60%)、CD11b(0.80%±0.05%)、CD45(1.39%±0.13%)和CD34(1.73%±0.08%).与心肌细胞共培养后第7天可在hBMSC细胞中观察到少量搏动的细胞,随着诱导时间的增加,细胞的搏动更规则、有力.与心肌发育有关的转录因子GATA4基因在诱导后1、2、3周均有表达.共培养后2周,检测的心肌标志蛋白均有阳性表达,分别是结蛋白,α-辅肌动蛋白,cTnI和cTnT.荧光标记也检测到cTnT和cTnI的阳性表达.结论 hBMSC具有向心肌细胞分化的潜能,在共培养的微环境中,可以分化成心肌细胞表型,其机制是通过心肌细胞的旁分泌作用,而不需要hBMSC与心肌细胞的直接接触.     

长链非编码RNA H19靶向miR-194-5p抑制LPS诱导心肌细胞炎症反应

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)H19对LPS诱导的心肌细胞炎症因子分泌的影响及其机制。方法建立LPS诱导的心肌细胞H9c2损伤模型;pc-con组(转染pc-con)、pc-H19组(转染pc-H19)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-194-5p组(转染anti-miR-194-5p)、pc-H19+miR-con组(pc-H19和miR-con共转染)、pc-H19+miR-194-5p组(pc-H19和miR-194-5p共转染)均用脂质体法转染至H9c2细胞;qRT-PCR检测各组细胞中H19、miR-194-5p的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β的含量;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞荧光活性。结果与Control组相比,LPS组心肌细胞中H19表达下调,miR-194-5p表达上调,且过表达H19、敲减miR-194-5p均可抑制LPS诱导的心肌细胞H9c2炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌;miR-194-5p是H19的靶标。过表达miR-194-5p可逆转过表达H19对LPS诱导心肌细胞炎症因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用。结论 H19可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症因子的分泌,其机制可能与靶向miR-194-5p有关,可为心血管损伤的治疗提供新靶点。     

兔骨髓间充质干细胞移植后移植细胞凋亡的实验研究

目的利用TUNEL法检测5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）移植后的凋亡情况。方法5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞MSCs向肌源性心肌细胞分化,通过免疫组化,鉴定诱导后的MSCs是否向类心肌细胞转化。建立兔心肌梗死模型,将细胞移植于心梗区域。移值2周后,利用TUNEL法检测植入细胞的凋亡率。结果移植2周后,可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,分布比较广泛,形态呈椭圆形类似心肌细胞核,并与心肌纤维排列方向一致,证明移植细胞已存活。移值细胞表达troponinT,证明移植的MSCs分化为类心肌细胞。移植细胞均出现不同程度细胞凋亡。结论移植的MSCs细胞可在缺血的心肌组织存活,并分化为类心肌细胞,但移植细胞均出现不同程度凋亡。     

TNNI3K基因过表达诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的研究肌钙蛋白Ⅰ相关激酶(TNNI3K)对小鼠胚胎干细胞(m ESC)向心肌细胞分化的影响。方法从形态和细胞免疫荧光、碱性磷酸酶试验以及HE染色鉴定m ESC的多能性。采用悬滴法培养m ESC形成拟胚体(EB),自分化为跳动的心肌细胞,通过细胞免疫荧光和透射电镜(TEM)方法鉴定。慢病毒分别携带h TNNI3K基因和siRNA感染m ESC,并分别自分化为心肌细胞,通过流式细胞术(FCM)、细胞免疫荧光、Western blot等分析心肌特异性蛋白表达水平的差异。结果 m ESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表达呈阳性(绿色),ALP试验呈蓝紫色,核质比1。正常自分化的细胞免疫荧光显示cTnⅠ、cTnT、MLC2以及α-actinin阳性(绿色),肌节清晰可见。TEM显示心肌细胞独有的肌纤维亚细胞结构。过表达组cTnT+阳性细胞率高于对照组,Western blot显示心肌特异性蛋白cTnT、cTnⅠ、MLC2、α-actinin等显著高于对照组,且细胞免疫荧光结果显示MHC6蛋白提前表达。干扰组不仅cTnT+阳性细胞率显著低于对照组,而且心肌特异蛋白也显著低于对照组,MHC6蛋白表达延后。结论TNNI3K基因能增强心肌细胞的生成,促进m ESC向心肌细胞的分化。     

NF-E2对红系造血相关基因表达的影响

目的探讨红系特异性转录因子NF—E2对红系造血相关基因表达的影响。方法应用基因芯片方法检测转染p45NF—E2基因后红白血病细胞株HB22．2中基因表达的变化；通过改变培养条件诱导红白血病细胞株HB60—5向成熟细胞分化，检测诱导分化过程中NF—E2等红系造血相关基因表达变化。结果p45NF-E2缺陷细胞HB22．2转染外源p45NF-E2后，血红蛋白基因及Gata-1、EDRF基因表达上调，Fli基因表达下调；HB60-5向成熟细胞分化过程中，随着p45NF—E2的表达上调，同样出现Gata-1和EDRF表达增强，FIi表达减弱。结论NF—E2能对多种红系相关基因表达调控。从而促进红系分化。     

Ghrelin以非经典受体依赖性方式促进人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的研究

目的 探讨Ghrelin对人胚胎干（hES）细胞定向分化为心肌细胞的影响. 方法 以不同浓度Ghrelin诱导hES细胞定向分化为心肌细胞,显微镜下计数搏动细胞团的比例,应用实时PCR检测心肌特异性标志物的表达.应用RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测分化细胞中生长激素促分泌物受体1α（GHSR1α）的表达,添加GHS-R1α拮抗剂[D-lys3]-GHRP-6,观察其对Ghrelin促分化作用的影响. 结果 与对照组比较,10-10、10-9及10-8 mol/L Ghrelin均可增加搏动细胞团的比例[搏动比例分别为（12.9±1.4）％％,（19.5±2.2）％及（13.5±3.1）％vs（10.3±2.2）％,P＜0.05].RT-PCR分析显示,Ghrelin可上调α-肌球蛋白重链（α-MHC）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达[α-MHC：100％ vs （40.1±13.2）％,P＜0.001;cTnI：100％ vs （52.6±9.8）％,P＜0.001].RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色均显示GHS-R1α在不同阶段的分化细胞中表达,但酰基化和非酰基化Ghrelin的促分化作用相似,且添加GHS-R1α拮抗剂不能阻断Ghrelin的促分化作用. 结论 Ghrelin可促进hES细胞定向分化为心肌细胞,该作用可能由GHS-R1α以外的信号途径所介导.     

携带TBX18的慢病毒载体转染脂肪干细胞并诱导其向起搏样细胞分化的研究

目的观察TBX18慢病毒载体在体外转染脂肪干细胞(ADSCs),能否诱导其向起搏样细胞分化。方法取40~50g SD大鼠的腹股沟脂肪,采用酶混合消化法分离培养ADSCs,光学显微镜下观察细胞形态,将细胞随机分为TBX18组、GFP组、null组,TBX18组转染携带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的TBX18慢病毒,GFP组转染等量的GFP慢病毒作为空病毒对照组,null组不转染病毒作为空白对照组。一周后通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测三组相关转录因子TBX3、ISL1、SHOX2,缝隙连接蛋白CX45、CX43、CX30.2及心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白I(cTNI)、肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量;通过免疫荧光技术检测TBX18组及GFP组的α-SMA蛋白的表达。病毒转染后第7、14、21、28天分别采用实时荧光定量聚合酶链式反(RT-PCR)检测TBX18组及GFP组TBX18及HCN4水平。结果 TBX18组转染ADSCs后,细胞形态发生改变,转染后4周内可通过荧光显微镜下观察到持续的荧光表达,诱导分化后,TBX18组TBX3、ISL1、SHOX2、CX45、CX30.2、cTN1、α-SMA蛋白水平明显高于GFP组及null组,而CX43蛋白表达低于null组;TBX18组免疫荧光检测到了α-SMA,而GFP组表达阴性;TBX18组TBX18及HCN4表达在慢病毒转染后4周内持续表达,明显高于GFP组(P0.05)。结论 TBX18慢病毒载体体外转染入ADSCs,能在细胞内稳定表达,且能使其向起搏样细胞分化。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

Integrin β1在维生素C诱导小鼠诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的:探讨整联蛋白β1（Integrin β1）在维生素C（Vc）诱导小鼠诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）向心肌样细胞(cardiomyocytes，CMs)分化中的作用。方法: 在立式显微镜下，分别摘取胚胎(12.5 d、14.5 d及16.5 d)BALB/c胎鼠、新生（出生1 d，P1）和成年BALB/c小鼠的心脏，提取总RNA，半定量及实时定量PCR分析心脏发育不同时期Integrin β1的表达。利用悬滴培养形成拟胚体(embryoid　body，EB)的方法体外诱导iPSCs向心肌样细胞分化，诱导过程中分别添加Vc和integrin β1抑制剂（HMβ1-1）处理，共分为3组:对照组、Vc处理组和Vc+HMβ1-1处理组。诱导分化的第3、5、7天，半定量及实时定量PCR检测Oct4、integrin β1和心肌特异性因子（α-MHC、MLC2a）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性结构蛋白心肌肌钙蛋白 I（cTnI）的表达。结果: Integrin β1在心脏胚胎发育时期（E12.5、E14.5、E16.5、P1）的表达递增（P<0.01），成年期表达有所回落（P<0.01）。半定量及实时定量PCR的结果提示，Vc组α-MHC、MLC2a的表达显著高于对照组（P<0.01），加integrin β1抑制剂HM β1-1后表达量降低(P<0.01)。跳动EBs计数的结果提示，诱导分化第10、14、18、22、26天，Vc组跳动EBs的百分率显著高于对照组（P<0.01）；而Vc+ HMβ1-1组跳动EBs的百分率相对于Vc组显著降低（P<0.01）。免疫荧光染色显示，Vc组有较强的cTnI表达，添加integrin β1抑制后，Vc+HMβ1-1组cTnI的表达明显减弱。结论: Vc可促进iPSCs向心肌细胞分化，其机制可能是通过integrin β1介导。     

体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化

长期以来人们一直在研究心肌再生的可能性。人工诱导多功能干细胞由于其在跨越了胚胎干细胞所面临的医学伦理学问题的同时具有多分化潜能而成为人们研究的热点。在体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的试验中,研究者对细胞进行向心肌细胞分化的诱导,检测其分化效率;对分化的心肌细胞进行基因、蛋白水平的验证,并对细胞电生理特性进行比较分析,发现其与正常心肌细胞在各个方面均相似。这些研究为寻找心肌损伤后心肌细胞再生提供了理论基础,并为人们研究心肌细胞在疾病病因学、明确药物效能以及最终的患者特异性治疗方面有广泛的应用价值,为转化医学提供了前景。     

鼠胚胎干细胞早期分化来源的心肌细胞同种异体移植后的电生理特性

目的 探讨小鼠胚胎干细胞早期分化来源的心肌细胞进行同种异体移植后的电生理特性.方法 首先通过电转染构建a-MHC-EGFP-ESc系[将心肌细胞特异的OL-MHC启动子与表达基因--绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,构建成真核表达载体],悬滴法诱导胚胎干细胞分化,在分化早期(7+4)d利用流式细胞仪筛选带绿色荧光的心肌细胞,将纯化的心肌细胞(5×106个/ml)移植到小鼠心室壁,对照组注入等体积培养基,移植前3 d开始应用环孢素A(静脉注射,5 mg·kg-1·d-1)和泼尼松龙(静脉注射,2.5 mg·kg-1·d-1)抑制免疫排斥反应.移植后2周分离两侧颈迷走神经行电刺激抑制窦房结与房室结,记录刺激前后的体表心电图,然后分别行免疫荧光显像和膜片钳研究.结果 刺激迷走神经前,移植组和对照组均呈正常的窦性心律,两组无室性心律失常的发生;刺激迷走神经后,两组动物均出现异位的心室起搏心律,细胞移植组与对照组心室频率无差异.移植区冰冻切片免疫荧光分析可见EGFP标记的移植细胞具有肌钙蛋白I(cTnI)表达,说明分化细胞移植后仍具有心肌特性,且移植细胞与宿主心肌细胞间有连接蛋白43的表达,表明移植细胞与宿主心肌细胞间形成电偶联通道.膜片钳分析,绿色荧光细胞移植前后其具有起搏细胞动作电位的比例分别为(85.1%vs 1 1.4%,P＜0.05),该类细胞在移植前后的起搏电流强度有所增强((11.2±2.4)pA/pF vs(15.5±1.9)pA/pF,P＜0.05].移植区分离的绿色荧光细胞中48%具有心室肌动作电位.结论 胚胎干细胞早期分化来源的心肌细胞在体移植后能进一步分化为成熟的心室肌细胞及起搏细胞.     

胚胎干细胞向心肌细胞分化机理的研究现状

目前有多种细胞可用于心肌细胞移植,其中胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)具有其独特的优势,因为由ES细胞向心肌细胞分化,经历了从早期前体心肌细胞,向终末分化成熟心肌细胞过渡的整个过程,是研究心肌细胞分化机理的良好模型.由胚胎干细胞分化为成熟心肌细胞,是在时空水平上多个细胞相互作用的结果,涉及细胞内复杂的基因调控过程.以下就胚胎干细胞向心肌细胞分化的细胞内外调控机制的研究现状加以综述.