P15^INK4B基因甲基化与骨髓增生异常综合征

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种造血干细胞的克隆性疾病，容易进展为急性白血病。P15^INK4B基因为人类肿瘤抑制基因，在负向调节造血细胞增生和阻止其恶性转换中起着重要的作用。近来研究显示P15^INK4B基因高度甲基化与MDS的发生、发展具重要关系，越是疾病进展期，P15^INK4B基因甲基化出现越频繁。5-氮杂胞苷(5-azacytidine)和5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(decitabine)用于治疗MDS患者已取得一定效果，三氧化二砷的体外试验显示其具有抑制MDS细胞株生长和去甲基化作用。去甲基化治疗有望成为今后治疗MDS的有效方案之一。     

5''''-杂氮-2''''-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨5'-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞体外作用的机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)转位及细胞凋亡;用RT-PCR检测p15INK4B基因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测p15INK4B基因甲基化程度.结果表明5-Aza-CdR对MUTZ-1细胞有生长抑制作用;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变.p15INK4B基因甲基化程度随5-Aza-CdR剂量增加而减弱,伴随p15INK4B基因mRNA表达增加.经3.2mmol/L 5-Aza-CdR作用48小时后,MUTZ-1细胞DNMT3AmRNA表达水平较未加药组明显下降(灰度比为0.3850.654,P＜0.05),DNMT1、DNMT3BmRNA表达水平与未药组相比无明显改变.结论在0.4-6.4 mmol/L浓度范围5-Aza-CdR通过诱导MUTZ-1细胞凋亡而抑制该细胞生长,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一.5-Aza-CdR可能通过下调DNMT3AmRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,从而恢复其表达.     

5′-杂氮-2′-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨 5′ 杂氮 2′ 脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 Aza CdR ,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征 (MDS)细胞体外作用的机制。以人MDS RAEB细胞株MUTZ 1细胞为研究对象 ,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率 ;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸 (PS)转位及细胞凋亡 ;用RT PCR检测 p15INK4B基因、甲基转移酶 (DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达 ;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测 p15INK4B基因甲基化程度。结果表明 :5 Aza CdR对MUTZ 1细胞有生长抑制作用 ;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变。p15INK4B基因甲基化程度随 5 Aza CdR剂量增加而减弱 ,伴随 p15INK4B基因mRNA表达增加。经 3.2mmol/L 5 Aza CdR作用 4 8小时后 ,MUTZ 1细胞DNMT3A mRNA表达水平较未加药组明显下降 (灰度比为 0 .385∶0 .6 5 4 ,P <0 .0 5 ) ,DNMT1、DNMT3B mRNA表达水平与未加药组相比无明显改变。结论 :在 0 .4 - 6 .4mmol/L浓度范围 5 Aza CdR通过诱导MUTZ 1细胞凋亡而抑制该细胞生长 ,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一。 5 Aza CdR可能通过下调DNMT3A mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降 ,从而恢复其表达。     

恶性血液病中的P_(15)~(INK4B)基因甲基化

目的　探索特定基因操纵区CpG岛高甲基化对人类造血系统恶性肿瘤的作用。方法　利用甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP)的方法 ,用亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板进行甲基化特异性聚合酶链反应 (PCR) ,测定了 2 5例急性髓系白血病 (AML) ,15例慢性粒细胞白血病 (CML) ,16例骨髓增生异常综合征 (MDS)和 12例多发性骨髓瘤 (MM)患者P1 5INK4B基因在操纵区 5′ CpG岛异常甲基化的发生率。结果　P1 5INK4B基因异常甲基化的发生率 :AML为 84% ,CML为 0 ,MDS为 5 0 % ,MM为 75 %。高危型的MDS较低危型更易发生甲基化。在MM中 ,P1 5INK4B甲基化一般发生在早期 ,与骨髓象的幼稚程度关系密切。结论　调节细胞生长和分化的P1 5INK4B基因高甲基化是使P1 5INK4B 基因失活的主要原因之一 ,CpG岛高甲基化与恶性血液病的发生密切相关。     

p15INK4B甲基化与骨髓增生异常综合征患者预后及地西他滨疗效的关系

目的 通过检测初诊骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15INK4B甲基化水平,观察地西他滨治疗前、后p15INK4B甲基化状态变化,探讨p15INK4B甲基化水平与预后的关系及其对地西他滨疗效的影响.方法 261例初诊MDS患者,其中男143例,女118例,中位年龄52(32 ～78)岁.低危组172例(低危104例、中危-1 68例),高危组89例(中危-2 52例、高危37例).收集患者骨髓单个核细胞,采用甲基化特异性PCR (MSP)检测p15INK4B甲基化水平,按p15INK4B甲基化程度对患者进行生存分析.采用MSP方法分别检测58例MDS患者地西他滨治疗前及治疗2个疗程后骨髓p15INK4B甲基化水平,分析p15INK4B甲基化对地西他滨疗效的影响.结果 低危组患者p15INK4B甲基化水平明显低于高危组患者(117.22对157.63,P＜0.05).p15INK4B甲基化阳性患者2年预期生存(OS)率低于阴性患者(69.8％对91.8％,P＜0.05);在低危组,p15INK4B甲基化阳性患者2年预期OS率低于阴性患者(78.2％对92.0％,P＜0.05);在高危组,p15INK4B甲基化阳性患者OS率及中位OS时间与阴性患者比较差异无统计学意义[35.6％对38.5％,(17.0±9.3)个月对(18.0±5.7)个月,P＞0.05].COX分析结果显示p15INK4B甲基化水平是OS时间的独立预后因素.治疗前p15INK4B甲基化阳性组患者地西他滨治疗的总反应率及完全缓解率与阴性组比较差异无统计学意义(65.9％对76.5％,22.0％对29.4％,P＞0.05).地西他滨治疗有效组p15INK4B甲基化水平在治疗前、后差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初诊时p15INK4B甲基化水平高的MDS患者生存时间更短,但p15INK4B甲基化水平对地西他滨疗效无明显影响.     

p15INK4b基因异常与骨髓增生异常综合征

在肿瘤抑制基因中，p15^INK4b基因由于在骨髓增生异常综合征（MDS）演进过程中的重要作用而逐渐受到关注，系列的研究表明，随着MDS向AML的演出一进，p15^INK4b基因由于其外显子1启动子区的5′CpG岛发生高度甲基化而失活，这种类型的甲基化限于MDS细胞克隆，用甲基化特异性PCR法可较为敏感地将其检测到，p15^INK4b基因的失活抑制了细胞因子如Fas抗原，TGF-β和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)蛋白介导的细胞凋亡，由于p15^INK4b基因甲基化与MDS的密切关系，调节基甲基化状态可能会成为治疗MDS的一个新途径。     

三氧化二砷诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1细胞p15INK4B基因表达的研究

目的 探讨三氧化二砷（As2O3)去甲基化作用的机制。方法 采用甲基化特异PCR（MSP）检测p15INK4B基因甲基化，RT－PCR方法检测p15，甲基转移酶（DNMT）1，DNMT3A，DNMT3B的表达，MTT法检测As2O3对MUTZ－1细胞的生长抑制。结果 MUTZ－1细胞有p15INK4B基因甲基化，p15基因弱表达，As2O3作用后p15INK4B基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，DNMT3A，DNMT3B mRNA的表达下降并呈浓度依赖性。结论 As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A，DNMT3B，或（和）直接对p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复共活性。     

丙戊酸钠对Molt-4细胞增殖的影响及其作用途径探讨

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对人急性T细胞白血病细胞系Molt-4细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其对Molt-4细胞p15INK4B基因甲基化状态的影响.方法 不同浓度VPA作用Molt-4细胞后,用MTr法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期的变化,半巢式甲基化特异PCR(MSP)法检测p15INK4B基因甲基化状态,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMrT3B mRNA的表达.结果 VPA可明显抑制细胞增殖,影响Molt-4细胞周期分布,5.0mmol/L VPA作用Molt-4细胞48 h,G0/G1期细胞为(66.87±3.31)%,S期细胞为(8.47±2.56)%,与未加VPA组相比,S期细胞明显下降,G0/G1期细胞明显升高(P＜0.05).经VPA作用后Molt-4细胞p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达水平明显增加,DNMT-1、DNMT3B mRNA表达水平下降,以DNMT-1下降较明显.结论 VPA可能通过抑制甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B表达使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制Molt-4细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期.     

骨髓增生异常综合征相关基因的研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是造血干细胞的异质性疾病,至今病因尚未完全清楚.近年来随着分子生物学技术的发展,对MDS相关基因的研究越来越多.研究证实,在MDS患者中存在一系列异常,包括基因甲基化、转录因子的突变和激酶突变等.本文就与MDS发病机制相关的P15~(INK4b)、RUNX1和FHIT等基因的研究进展作一综述.     

5-氮杂胞苷治疗骨髓增生异常综合征的研究现况

DNA异常甲基化是骨髓增生异常综合征的发病机制之一，去甲基化治疗是一种作用机理不同于传统化疗药物的新方法。5-氮杂胞苷（azacitidine）是一种胞嘧啶核苷类似物，它能掺入DNA，抑制DNA甲基化转移酶，使DNA去甲基化，重新激活由于过度甲基化而失活的基因。本文就近年来5-氮杂胞苷在骨髓增生异常综合征中的临床研究进展作一综述。     

DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨对SKM-1细胞P15~(INK4B)基因甲基化状态的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)对骨髓增生异常综合征(MDS)转白血病细胞株SKM-1 P15INK4B基因甲基化状态的影响。方法对数生长期的SKM-1细胞设4组,每组1×106个细胞,其中3组为DAC处理组,分别以1.5、3.0和6.0μmol/L DAC处理SKM-1细胞48 h,另1组未加DAC的SKM-1细胞培养48 h作为对照组。甲基化特异性PCR(MSP)检测各组细胞P15INK4B基因甲基化情况,实时荧光RT-PCR相对定量法检测P15INK4B基因mRNA表达情况,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)法检测细胞增殖抑制情况,碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡情况。结果 1)对照组SKM-1细胞的P15INK4B基因完全甲基化,3个DAC处理组的甲基化条带逐渐变浅,非甲基化条带出现并逐步加深;2)P15INK4B基因mRNA表达水平:对照组与DAC为1.5、3.0、6.0μmol/L的3个处理组分别为1.00±0.12与0.91±0.13、0.51±0.06、0.43±0.04(P0.05),3个DAC处理组之间差异甚微(P0.05);3)CFSE平均荧光强度(MFI):对照组与DAC为1.5、3.0、6.0μmol/L的3个处理组分别为51.67±1.61与55.33±2.28、56.33±2.50、55.71±2.87,仅3.0μmol/L组较对照组变化较明显(P0.05),而各DAC处理组之间变化差异很小(P0.05);4)G1期细胞比例(%):对照组与DAC为1.5、3.0、6.0μmol/L的3个处理组分别为55.78±3.61与48.12±2.93、51.69±1.60、46.71±1.54,S期细胞比例(%):4个组分别为44.22±3.61与51.88±2.93、48.31±1.60、53.29±1.54,其中1.5、6.0μmol/L组较对照组变化较明显(P0.05),而DAC各处理组中,6.0与3.0μmol/L组之间具明显差异(P0.05);5)早期凋亡率(%):对照组与DAC为1.5、3.0、6.0μmol/L的3个处理组分别为2.91±0.26与7.77±0.22、12.45±0.28、13.86±0.27(P0.05),DAC各处理组没有明显变化(P0.05)。结论 DAC能逆转SKM-1细胞的P15INK4B基因完全甲基化状态,在一定程度上抑制SKM-1细胞的增殖,使细胞分化阻滞在S期,同时促进细胞凋亡,并随DAC浓度的增加而增强;尚未发现DAC逆转P15INK4B基因甲基化状态的同时使沉默的P15INK4B基因mRNA重新表达。     

5-氮杂脱氧胞苷对白血病细胞生长作用及相关基因表达的影响

目的　探讨甲基化抑制剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine,5 aza CdR)去甲基化治疗白血病的作用机制。方法　采用MTT实验、硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验和DNA凝胶电泳的方法 ,观察 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞增殖、分化和凋亡的影响 ;通过RT PCR和甲基化特异性PCR方法检测DNA甲基转移酶 (DNMT)、p15、p5 3、bcl 2基因表达变化和p15基因的甲基化状态。结果　 5 aza CdR对HL 6 0、K5 6 2细胞和白血病原代细胞的生长抑制有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 0 .5 μmol/L 5 aza CdR对HL 6 0细胞有较明显的促分化作用。不同浓度 5 aza CdR处理细胞后 ,有不同程度的p15、p5 3mRNA表达上调和bcl 2mRNA表达下调 ,DNMTmRNA表达水平在处理前后无明显变化。在原代白血病细胞中 ,p15基因甲基化程度随着 5 aza CdR浓度的增加逐渐减低。结论　 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞的增殖均有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与p15、p5 3基因的上调以及bcl 2基因的下调有关 ,p15 INK4B基因甲基化程度的降低 ,主要与 5 aza CdR的竞争性抑制有关 ,而不是由DNMT基因的下调所致     

骨髓增生异常综合征发病机制的研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病。MDS的发生发展过程中,包含了骨髓细胞的凋亡、增殖及克隆扩张等多重机制。不同克隆的产生,可能与控制细胞凋亡或生长分化的基因有关。肿瘤坏死因子-α、Fas抗原以及增殖的T细胞克隆参与了MDS的发病机制。MDS向白血病的转化与p15INK4b基因的高度甲基化有关。     

多基因甲基化在骨髓增生异常综合征患者中的预后价值

目的:分析p15、DAPK、SOCS1和FHIT基因在骨髓增生异常综合征(MDS)患者中的甲基化状况,探讨基因甲基化在MDS中的预后价值。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)对67例MDS患者骨髓进行上述4种基因甲基化的检测,选择18例缺铁性贫血患者作为对照,分析MDS患者基因甲基化状况及其对生存率的影响。结果:67例M DS患者中p15、DAPK、SOCS1和FHIT 4种基因甲基化率分别为37.3%、35.8%、47.8%和52.2%,较对照组显著增高(P0.05);随着国际预后积分系统(IPSS)评分的增加,p15、SOCS1基因甲基化率呈增高趋势(P0.05),同时表达≥2个基因甲基化更易见于相对高危组患者(P0.05)。生存分析显示,有基因甲基化和无基因甲基化患者的中位生存时间分别为15和21个月(P0.05),在相对低危组中SCOS1基因甲基化患者生存时间短于非甲基化患者(P0.05),在相对高危组中SOCS1、p15及≥2个基因甲基化患者生存时间明显短于非甲基化患者(P0.05)。多因素分析显示,SOCS1及p15基因甲基化是MDS患者预后不良的影响因素。结论:p15、DAPK、SOCS1和FHIT是M DS中出现较高的甲基化基因,SOCS1及p15基因甲基化是M DS患者不良预后的独立危险因素。     

去甲基化药物在骨髓增生异常综合征患者异基因造血干细胞移植中应用的研究进展

去甲基化药物(HMA)在骨髓增生异常综合征(MDS)患者中具有良好的抗肿瘤作用.目前,MDS患者于接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)前,应用HMA作为桥接治疗是减少该病患者肿瘤负荷的重要治疗方法之一.同时,研究显示,MDS患者于接受allo-H SCT后应用HMA,对于预防及延缓疾病复发具有一定作用.笔者拟就MDS患者在接受allo-HSCT前、后应用HMA的研究进展进行综述如下.     

骨髓增生异常综合征患者地西他滨治疗后DNA甲基化水平变化

目的 了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者地西他滨治疗后DNA甲基化水平的变化.方法 7例MDS患者难治性贫血伴原始细胞增多Ⅰ型或Ⅱ型(RAEBⅠ/Ⅱ)接受规律的地西他滨治疗,5天方案(4例)和3天方案(3例),每个疗程分4个时间点采集其外周血,实时荧光定量聚合酶链反应( real time-Q-PCR)方法检测外周血P15和CDH1基因的甲基化水平.结果 用药前3例患者(例2、例4和例7)P15甲基化水平较高(20％～65％),CDH1均较低(0.5％～5％).无论5天还是3天方案,用药前甲基化水平越高,用药后下降越明显,患者用药第5/7天后P15、CDH1甲基化水平下降幅度最大,达20％～60％,P15可维持在下降后的水平,在随后的治疗中未再出现明显的下降,但是CDH1的波动较大,用药期间CDH1甲基化水平可升至≥用药前水平.目前的数据表明甲基化的变化与血象变化不一致.应用重复测量方法分析5天与3天方案两个基因甲基化水平变化,两种不同方案组间去甲基化水平差异无统计学意义(均P ＞0.05);有血液学改善的患者与未改善患者的去甲基化程度差异无统计学意义.结论 地西他滨治疗后P15和CDH1的甲基化水平均有不同程度降低,但甲基化水平与治疗方案和疗效无关.     

VPA和As2O3对Molt-4细胞的协同作用及可能机制

本研究探讨丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）单药或与亚砷酸（arsenie trioxide，As2O，3）联用对人急性T细胞白血病细胞株Molt-4增殖活力的抑制、去甲基化作用及其可能机制。用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用，利用金氏公式观察两药联用体外抗癌的协同作用。采用半巢式甲基化特异PCR（hnMS—PCR）检测p15INK4B基因甲基化，RT—PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMT3B的表达。结果表明：VPA和As2O3均可明显抑制细胞增殖，二者联用在体外有相加作用（Q值均大于0．85），在5mmol／LVPA与10μmol／LAs2O3联用时抑制率达（70．31±2．54）％。Molt-4细胞p15基因因高甲基化而失表达，经VPA和As2O3联合作用后p15基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，两药联用时DNMT-1、DNMT-3A、DNMT3B mRNA的表达都有下降。结论：VPA可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT-1和（或）DNMT3B使p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复其活性。VPA和As2O3均可明显抑制Mol-4细胞增殖，两药合用有协同相加作用，可减少砷剂的副作用。     

LRP15基因启动子区甲基化与其表达的关系

为了研究LRP15基因启动子区的甲基化状况及其与基因表达的关系,探讨LRP15基因的甲基化调控机制,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS—PCR)检测LRP15基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(CdR)及去乙酰化酶抑制刑曲古抑菌素(TSA)诱导CpG岛去甲基化及组蛋白乙酰化,观察启动子区CpG岛甲基化与基因表达的关系。结果显示：白血病细胞系K562中LRP15基因启动子区呈高甲基化状态,并抑制了该基因的表达。单独应用或联合TSA应用CdR均可去除该基因启动子区的高甲基化状态,并诱导该基因的表达。这表明LRP15基因的表达受到启动子区甲基化的调控;该基因在K562细胞系中不表达与其启动子区高甲基化及组蛋白去乙酰化密切相关。结论：甲基转移酶抑制剂与去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中可能具有一定的价值。     

P16基因甲基化与淋巴细胞-浆细胞肿瘤的发生发展

基因启动子区CpG岛甲基化常导致基因沉默。P16基因是一定位于9p21的多种肿瘤抑制基因,通过pl6INK4A-cyclinD1-PRb通路维持机体细胞的有序增殖。P16基因甲基化在淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤等多种淋巴细胞-浆细胞肿瘤中被检测到,并与疾病的发生、发展存在一定关系,应用甲基化抑制因子或砷剂去甲基化治疗,恢复基因功能可望成为血液恶性肿瘤治疗的一种新手段。本文就P16基因甲基化机制及P16基因甲基化与淋巴细胞-浆细胞肿瘤(淋巴瘤、急性和慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓病)的关系作一综述。