细粒棘球蚴（包虫）抗原4及抗原5的研究进展

包虫病(Hydatidosis)的高特异性、高敏感性诊断方法的建立是包虫病免疫学研究的一个重要课题,了解细粒棘球蚴抗原的精细化学性质和生化性状,寻找特异性抗原组分是解决此问题的关键。本文就国内外对细粒棘球蚴主要抗原组分抗原4(antigen 4,Ag4)和抗原5(antigen5,Ag5)的研究现状作一综述。包虫病的血清学诊断通常采用包虫囊液作为抗原来源。由于其为多种组分的混合物,含有蛋白质、碳水化合物、虫体终代谢产物及其宿主组织成份,而且,不同宿主及同一宿主不同寄生部位的细粒棘球蚴,其囊液的抗原性相差很大(称为粗抗原),它和其它蠕虫病血清学交叉反应严重,敏感性也较低,严重限制了包虫病免疫诊断用抗原的标准化和临床诊断标准的统一,因此,     

细粒棘球蚴重组犛狋 犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀疫苗构建与免疫性分析

摘要：目的　探讨以减毒沙门菌为载体,构建表达细粒棘球蚴Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉ蛋白口服活载体疫苗的可行性。方
法　从细粒棘球蚴包囊中分离原头节, 超声粉碎后提取总ＲＮＡ, 通过ＲＴ ＰＣＲ 扩增细粒棘球蚴
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀基因, 然后将犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀基因插入到ｐＹＡ３３４１ 表达载体中, 构建重组质粒ｐＹＡ３３４１
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,将重组质粒依次电转入减毒鼠伤寒沙门菌Ｘ３７７０ 和Ｘ４５５０,获得重组菌株犛狋 犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,
对重组菌的稳定性、安全性以及免疫原性进行评价。结果　经酶切鉴定成功构建了重组质粒ｐＹＡ３３４１
犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ蛋白在重组菌中获得了表达;重组菌株在体外至少传代１０次
而保证重组质粒不丢失;小鼠免疫试验证实,重组菌安全无毒性;重组菌口服免疫小鼠可检测到Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ
特异性ＩｇＧ抗体。结论　本试验成功构建了能稳定表达细粒棘球蚴Ｅｇ．ｆｅｒｒｉｔｉｎ蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌
活载体疫苗株,并显示了良好的免疫原性和安全性,为包虫病新型口服基因工程活载体疫苗的研制奠定基础。
关键词：细粒棘球蚴;犈犵．犳犲狉狉犻狋犻狀;减毒鼠伤寒沙门菌;免疫原性
中图分类号：Ｒ３８３．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０５ ０４９５ ０４     

细粒棘球绦虫延伸因子1生物信息学分析

目的 利用生物信息学技术对细粒棘球绦虫的延伸因子1（EF-1）进行分析,探讨其诊断价值。方法 通过 Expasy系统预测EF-1的理化性质,使用DNAStar软件分析蛋白亲水性、柔性区域、抗原指数及表面可及性,利用ABCpred与IEDB软件综合预测B细胞线性抗原表位,通过DNAStar 软件预测T细胞表位,使用SOPMA软件预测二级结构,SWISS-MODEL 网站构建EF-1的三级结构,使用MEGA软件选择neighbor joining 法构建EF-1氨基酸序列的系统发育树。结果 EF-1基因序列全长1 412 bp,含有2个内含子;EF-1亲水性得分较高的区域为35~45、52~70、126~140、158~183、301~322、357~380、424~448;柔性区域为26~45、54~71、162~176、300~318、357~381、432~448;抗原性指数得分较高的区域分布与柔性区域一致;表面可及性得分较高的区域较少,主要分布在39~54、62~76、128~132、161~170、220~234、315~329、354~372、424~448;可能的B细胞线性表位的氨基酸序列为120~130、286~295、306~320、365~378;可能的优势性T细胞表位区域为34~48、164~177、222~244、280~290、321~330、396~407;EF-1的二级结构中α螺旋占32.81%、β折叠占22.54%、β转角占10.94%、无规则卷曲占33.71%;系统发育树结果表明多房棘球绦虫为一枝,其余聚于一枝,且内部形成许多梳齿状分枝。结论 得到4个可能形成B细胞表位的区域、6个优势性T细胞表位区域,EF-1具有较高的保守性,可作为免疫诊断和药物治疗靶点。     

细粒棘球蚴内蒙株疫苗侯选基因克隆及分析

目的 为确定细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)基因的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法 根据已报道的细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白的基因序列(AY024340和AF321119)设计引物,进行FABP基因扩增。结果 成功克隆到细粒棘球蚴内蒙株FABP基因,扩增片段为482bp;序列比对结果显示,细粒棘球蚴内蒙株FABP基因与国内株FABP基因(GenBank登录号为AY024340)序列完全一致,同源性为100%;与国外株FABP基因(GenBank登录号为AF32I119)的同源性为99%。结论 细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白有潜在的抗原表位位点,为研究该蛋白的免疫功能及构建FABP核酸疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学技术对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)14-3-3zeta蛋白的结构和功能进行预测和分析,为进一步的实验研究提供依据。方法利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://expasy.org/)提供的各种有关基因和蛋白序列、结构信息分析的工具,并结合其它生物信息学分析软件,对该蛋白质的结构和功能进行预测和分析。结果该基因全长为771 bp,编码256个氨基酸,其编码的蛋白相对分子量理论预测值和等电点分别是29.4 kDa和5.04。预测该蛋白无信号肽和跨膜区,二级结构含8个α-螺旋和12个β-折叠股,氨基酸序列中有9个潜在抗原表位。结论初步认识了细粒棘球绦虫14.3-3zeta蛋白的基本特征,为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫Eg18抗原表位预测

目的 通过生物信息学技术预测细粒棘球绦虫Eg18 抗原B、T细胞表位,为细粒棘球绦虫筛选具有保护性抗原表位的抗原提供理论基础。方法 使用Expasy系统预测理化性质;二、三级结构的预测使用在线预测网站Predict Protein;通过在线软件ABCpred、LEPS结合二级结构、亲水性指数、表面可及性指数、柔韧性指数对B细胞表位进行预测;应用SYFPEITHI及IEDB软件预测MHC-Ⅰ类HLA-A0201限制性T细胞表位。结果 Eg18抗原二级结构中α-螺旋结构占氨基酸残基总数的98.1%,无规则卷曲占1.9%,无β-折叠结构;选出具有优势的30~41、55~71、110~126、136~144四个可能为Eg18蛋白B细胞表位的氨基酸序列区域;17~27、32~41、61~72、96~105四个较有可能形成T抗原表位的氨基酸序列区域。结论 通过生物信息学预测Eg18 抗原可能有4个B细胞表位且为构象表位,有4个T抗原表位,可为进一步了解Eg18 抗原提供参考。     

利用单克隆抗体纯化棘球蚴诊断抗原

单克隆抗体(单抗)B是敏化的脾细胞与骨髓细胞杂交的产物,成为新的重要生物学分析的成分。Felice等(1986)用杂交方法获得28株细胞克隆,生产抗E·grannlosus中绦期(棘球蚴)单抗,用其成功地纯化了用于棘球蚴病诊断的抗原5。Chamekh(1990)获得抗绵羊棘球蚴抗原5单抗,Deplazes等获得多房棘球蚴(Em2 E.multilocularis)抗原单抗,前者用于抗原鉴别,后者用于除去杂质的抗原纯化。     

细粒棘球蚴EgG1Y162-2基因的克隆、蛋白表达及纯化鉴定

目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白,为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板,利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因,经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET...     

Bioinformatics analysis of EgA31 and EgG1Y162 proteins for designing a multi-epitope vaccine against Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis (CE) is a global zoonosis caused by the larvae of the parasite Echinococcus granulosus (E. granulosus). According to its life cycle and previous studies of antigen candidates for vaccines against E. granulosus, we chose two proteins expressed at different stages of the E. granulosus life cycle to design a multi-epitope vaccine. The EgA31 antigen gene is derived from the adult stage of E. granulosus, and the EgG1Y162 antigen gene is derived from the larval stage of E. granulosus. In this study, we used several bioinformatics methods to analyze various aspects of the EgA31 and EgG1Y162 proteins, including the physicochemical properties, secondary and tertiary structures, and the dominant T-cell and B-cell epitopes. The results showed that EgA31 protein was an unstable and hydrophilic protein, while EgG1Y162 was stable and hydrophobic. The secondary structure of the EgA31 protein consisted of 82.36% alpha helixes, 4.16% extended strands, 3.16% beta turns and 10.32% random coils. The secondary structure of EgG1Y162 consisted of 33.33% alpha helixes, 25.49% extended strands, 5.88% beta turns and 35.29% random coils. Moreover, our results identified 6 dominant T-cell epitopes and 5 dominant B-cell epitopes in the EgA31 protein structure and 6 dominant T-cell epitopes and 3 dominant B-cell epitopes in EgG1Y162. In conclusion, this study provides comprehensive biological information about the EgA31 and EgG1Y162 proteins, which will lay a theoretical foundation for multi-epitope vaccines against Echinococcus granulosus.     

亚洲带绦虫膜联蛋白B3基因生物信息学分析

目的 识别亚洲带绦虫新基因,分析和预测该基因及其编码蛋白的结构和特性,为其生物学功能研究提供依据.方法 利用在线生物信息学网站及工具进行序列分析、预测其编码的膜联蛋白B3的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象、进化树等.结果 该基因全长1176 bp,编码区为70~588 bp,编码173个氨基酸,为全长基因;无跨膜区;具有多个磷酸化位点和B细胞线性表位;蛋白的理化性质稳定,理论分子量为19339.7;没有质体、线粒体定位序列;氨基酸序列高度保守.结论 运用生物信息学方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中识别出了亚洲牛带绦虫成虫膜联蛋白B3基因,并对其所编码的蛋白质的结构与功能进行预测.     

TRIM29在前列腺癌鉴别诊断中的意义

目的探讨TRIM29在前列腺良恶性病变中的表达及鉴别诊断的意义。方法用免疫组化法对比68例前列腺癌、7例前列腺上皮内瘤(PIN)及56例良性前列腺增生组织中TRIM29表达情况,以34βE12表达情况为对照。结果 TRIM29在68例前列腺癌中均不表达,而在7例前列腺上皮内瘤(PIN)及56例良性前列腺增生中表达均为阳性,与34βE12表达情况一致。结论 TRIM29可以作为前列腺病变基底细胞的特异性标记物之一。     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的 构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法 根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。     

Bioinformatics features and immunogenic epitopes of Echinococcus granulosus Myophilin as a promising target for vaccination against cystic echinococcosis

Cystic echinococcosis (CE) is a neglected zoonosis especially in underdeveloped countries around the world. Hence, immunization strategies are beneficial to avert the infection. The present investigation was aimed to predict the primary biochemical characteristics of the EgMyophilin and its potential B-cell and human leukocyte antigen (HLA)-binding epitopes as a promising vaccine candidate. Different web servers were used to predict physico-chemical, antigenic and allergenic profiles, transmembrane domain, subcellular localization, post-translational modification (PTM) sites, secondary and 3D structure, tertiary model refinement and validations. B-cell and HLA-binding epitopes were predicted and screened in terms antigenicity, allergenicity, solubility (B-cell) or hydrophobicity (T-cell). The 89.82 KDa protein was non-allergenic, hydrophilic, stable, with improved thermotolerance and 94 post-translational modification sites. The secondary structure included 42.94% alpha helix, 42.82% random coil and 41.23% extended strand. Based on Ramachandran plot output for refined model, 96.2%, 99.5%, and 0.45% of amino acid residues were incorporated in the favored, allowed, and outlier regions of the refined model, respectively. After epitope screening, four B-cell and five HLA-binding epitopes possessed the highest antigenic index in the protein sequence. This paper is a premise for further researches, and provides insights for the development of a suitable vaccine against CE. More empirical studies are required using the EgMyophilin alone or in combination with other antigens/epitopes in the future.     

金雀异黄酮对结肠癌细胞HT-29增殖及凋亡的影响

目的观察植物雌激素金雀异黄酮(GS)对人结肠癌细胞HT-29增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子生物学作用机制。方法采用MTT比色法和流式细胞术检测GS对HT-29细胞增殖活力和细胞周期分布的影响;CellDeathELISA和流式细胞术从不同方面检测GS对HT-29细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western-blot技术检测GS对核增殖抗原PCNA、bcl-2和baxmRNA和蛋白质表达的影响。结果与对照组相比,在15~120μmol/L浓度范围内,GS能够抑制HT-29细胞增殖活力;降低S细胞分布比例,将细胞周期滞留在G2/M期;显著性诱导HT-29细胞凋亡(>30μmol/L,P<0.05),并呈现出良好的剂量-效应关系。检测GS对PCNA、bcl-2和bax表达的影响显示,GS能够抑制PCNA和bcl-2mRNA和蛋白质表达,对bax的表达则表现出促进作用。结论GS通过诱导HT-29细胞凋亡而抑制其增殖活力,这些效应与PCNA、bcl-2和bax的表达变化有关。这些资料可为结肠癌的早期预防提供膳食干预新途径,并为临床新药的开发提供新方案。     

氯化饮用水的煮沸效果—遗传毒性变化和对细胞色素P—450及其自由基效应影响的研究

氯化饮用水浓缩液对大鼠肝细胞色素P-450(CytP-450)酶系具有程度不等的抑制作用,对其代谢相关的化学发光(CL)效应却具有明显诱导作用。但水煮沸后,遗传毒性有所降低,且对前者的抑制和对后者的诱导作用都明显减轻。提示自由基效应和氯化水的遗传毒性相联系;煮沸能有效减轻对CytP-450酶系的抑制和对细胞过氧化态的诱导以及缓解对突变基因表达的促进作用。     

Serological Evaluation of EgAgB16 kDa,a Recombinant Antigen from Echinococcus granulosus for Diagnosis of Human Hydatidosis

Background

Regarding that accurate diagnosis of human hydatidosis still needs more investigations, the present study was conducted to clone, express, and evaluate the gene encoding AgB subunits (EgAgB16 kDa) from Echinococcus granulosus (Iranian G1 strain) and its evaluation by ELISA test.

Methods

DNA was extracted from protoscoleces and was utilized by PCR for strain identification. Total RNA was prepared with RNeasy protect mini kit from E. granulosus (Iranian G1 strain) protoscoleces collected from naturally infected sheep with hydatid cyst. Recombinant AgB16 kDa was produced using pETDuet as vector and evaluated by ELISA method. A panel of sera including hydatid cyst-infected individuals (n=72), healthy individual (n=48), toxoplasmosis (n=4), strongyloidosis (n=4), kala-azar (n=5) and tuberculosis (n=5) were examined using this recombinant antigen.

Results

Recombinant protein was purified by affinity chromatography using His-Tag column. After purification, recombinant protein was confirmed by western blot analysis using His Tag monoclonal antibody or hydatid positive human serum. The sensitivity, specificity; positive and negative predictive values were calculated as 93.5%, 95.6%, 96% and 92.9%, in that order. The cut-off point was detected 0.3 for rAgB16.

Conclusion

While the produced recombinant AgB16 kDa showed promising results in diagnosing human hydatidosis, but more investigations should be implemented to reach an accurate gold standard.