黑素瘤细胞培养上清液抑制小鼠腹腔巨噬细胞分泌白介素-12的研究

目的:探讨M14黑素瘤细胞培养上清液(melanomaculturesupernatants,MCS)在体外对小鼠腹腔巨噬细胞分泌白介素(IL)-12的影响。方法:将小鼠腹腔巨噬细胞在体外分别以脂多糖(LPS)(10μg/mL)、MCS(100μg/mL)、PD98059(20μmol/L)等单独及共同作用,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清液中巨噬细胞IL-12p40的分泌,用免疫印迹(Westernblot)法分析巨噬细胞细胞外调节蛋白激酶(ERK)44/42/丝裂原激活蛋白酶(MAPK)、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)蛋白表达。结果:MCS在体外能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-12p40[(12.82±2.87)ng/mL],且培养上清液中IL-12水平的降低与细胞核磷酸化的ERK44/42蛋白表达增强相一致;此外,经ERK44/42特异性抑制剂PD98059预处理的巨噬细胞其IL-12p40的分泌量却不受MCS抑制[(25.23±4.52)ng/mL,P>0.05]。结论:黑素瘤细胞分泌物通过活化ERKMAPK信号传导通路抑制小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-12。     

多西紫杉醇对黑素瘤B16F10细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨多西紫杉醇对黑素瘤B16F10细胞增殖及凋亡的体外作用.方法:以不同浓度多西紫杉醇处理B16F10细胞,MIT法检测细胞增殖速度,倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞周期分布,TUNEL法检测原位细胞凋亡.结果:多西紫杉醇呈剂量和时间依赖性抑制细胞增殖.以多西紫杉醇10μmol/L处理B16F10细胞,24h即可出现细胞形态改变,G<,2/M期阻滞,但凋亡细胞数目增多不明显(P<0.05);作用48h凋亡细胞数目明显增多(P0.05).结论:多西紫杉醇具有抑制B16F10细胞增殖、诱导细胞凋亡等作用,细胞凋亡的发生迟于周期阻滞.     

大蒜素对小鼠黑素瘤细胞B16-F1增殖和凋亡的影响

目的探讨大蒜素对小鼠黑素瘤细胞B16-F1增殖及凋亡的影响。方法传代培养小鼠黑素瘤B16-F1细胞,使细胞浓度为5×104个/m l,分别加入不同浓度(3,6,9,12,15μg/m l)的大蒜素细胞培养液。培养12,24,36,48 h后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生存活性,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,定量RT-PCR法检测ras基因的表达水平。结果3~15μg/m l的大蒜素对B16-F1细胞均有杀伤作用,当大蒜素的浓度为3~6μg/m l,诱导肿瘤细胞凋亡,且呈浓度时间相关性。当大蒜素的浓度较高时,细胞呈中毒反应,凋亡作用不明显。3~15μg/m l的大蒜素下调ras基因的表达,并且呈显著的浓度相关性。结论大蒜素对小鼠黑素瘤B16-F1细胞有杀伤作用,可以明显诱导肿瘤细胞的凋亡,并且对肿瘤细胞ras基因的表达均有不同程度的下调作用。     

干扰BAG-1表达对黑素瘤B16F10细胞放射敏感性的影响

目的: 明确BAG-1基因表达对黑素瘤B16F10细胞放射敏感性的影响及机制。方法: B16-F10细胞株分为未转染组(Control组)、阴性对照质粒转染组(NC-shRNA组) 和转染BAG-1-shRNA 组(BAG-1-shRNA组)。 克隆计数法计算克隆形成率和存活分数,描绘细胞存活曲线。流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测BAG-1沉默对黑色素瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase3、8、9、PARP表达。结果: X线8Gy 剂量照射后,Control组、NC-shRNA组和BAG-1-shRNA组细胞的存活率分别为1.9%,1.75%和0.32%,细胞凋亡率分别为7.1%,9.2% 和25.3%,差异具有统计学意义（均P＜0.05）。BAG-1-shRNA组调亡蛋白c-PARP及c-caspase 3、caspase 8、caspase 9水平分别为0.36, 0.37,0.35和0.30高于control组（0.10,0.04,0.11, 0.2）和NC-shRNA组（0.13, 0.12, 0.20, 0.26）。讨论: 干扰BAG-1基因表达可显著增高黑素瘤B16F10细胞对X放射线的敏感性,促进细胞凋亡可能是放射增敏的机制之一。     

Notch-RBP-J信号通路对小鼠黑素瘤细胞B16F10与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养巨噬细胞极化影响的研究北大核心CSCD

目的 探讨小鼠黑素瘤细胞B16F10与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养中Notch-RBP-J信号通路对巨噬细胞表型分化的影响.方法 设计针对CBF1/RBP-Jκ基因的siRNA编码序列,转染至小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞.实验分4组：沉默前共培养组,B16F10细胞与RAW264.7细胞共培养;沉默后共培养组,B16F10细胞与RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7细胞共培养;空白对照组,单独培养的RAW264.7细胞;阳性对照组,白细胞介素4刺激诱导的RAW264.7细胞.Western印迹法、ELISA法及流式细胞仪检测各组巨噬细胞的表型;RT-PCR法检测各组notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表达.采用SPSS17.0软件进行重复测量方差分析及单因素方差分析、线性趋势检验、Bonferroni两两比较.结果 Western印迹结果显示,RAW264.7与B16F10共培养不同时间后,RAW264.7细胞的CD163在空白对照组、共培养24 h、48 h、72 h组、阳性对照组的相对表达量分别为1.016±0.018、1.274±0.034、2.065±0.094、3.615±0.144、3.099±0.071,经单因素方差分析（n=4）,F=527.42,P＜ 0.01,共培养后RAW264.7细胞CD163表达量较空白对照组增加;ELISA检测结果显示,共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10的水平分别为（167.610±3.527）、（433.433±5.558）、（679.673±8.101） ng/L.沉默后共培养24、48、72 h,RAW264.7细胞培养上清液白细胞介素10表达量分别为（63.403±0.856）、（103.427±2.072）、（202.297±3.610） ng/L,较未沉默时降低（F=8.01,P＜ 0.05）.Western印迹法及流式细胞仪分别检测沉默后共培养RAW264.7细胞CD163、CD206的表达量,均较未沉默时减少（P＜0.05）.RT-PCR示,沉默后共培养组较沉默前共培养组及对照组的Notch信号通路相关基因mRNA表达均降低.结论 沉默Notch-RBP-J信号通路后共培养组中RAW264.7细胞向M2型极化较未沉默共培养组减少,总体表型仍为M2型;该通路的活化促进RAW264.7细胞向M2型极化.     

补骨脂素和女贞子对小鼠B16黑素瘤细胞c-KIT表达的影响

目的探讨中药补骨脂素和女贞子对小鼠B16黑素瘤细胞c-KIT表达的影响及意义。方法体外培养小鼠B16黑素瘤细胞,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)测定补骨脂素和女贞子对小鼠B16黑素瘤细胞c-KIT表达的影响,用Transwell小室法检测补骨脂素和女贞子对小鼠B16黑素瘤细胞迁移功能的影响。结果补骨脂素与女贞子用药组迁移到膜下层的每视野细胞个数分别较对照组多(P0.05),并呈剂量依赖关系;用药组c-KIT m RNA、c-KIT蛋白表达分别比对照组增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论补骨脂素和女贞子可能是通过促进小鼠B16黑素瘤细胞c-KIT的表达而促进其迁移功能,从而对白癜风产生治疗作用。     

T-钙黏蛋白对小鼠皮下氮烯咪胺耐药黑素瘤B16F10细胞株的影响

目的观察T-钙黏蛋白(cadherin)对小鼠皮下氮烯咪胺(dacarbazine,DTIC)耐药黑素瘤B16F10细胞株的影响。方法通过体外分步诱导法诱导B16F10氮烯咪胺耐药细胞株(DTIC-R B16F10)。采用CCK-8法检测DTIC-R B16F10细胞的增殖情况。将T-cadherin基因转染至DTIC-R B16F10细胞。免疫组织化学检测转染后T-cadherin的表达情况。培养DTIC-R B16F10细胞,分为6组:对照组、pEGFP-N1组、T-cadherin组、DTIC组、pEGFP-N1联合DTIC组和T-cadherin联合DTIC组。通过CCK-8法和Transwell小室实验检测T-cadherin与氮烯咪胺联合对DTIC-R B16F10细胞活性和迁移的影响。建立荷瘤小鼠模型,观察T-cadherin对小鼠皮下注射DTIC-R B16F10细胞后肿瘤生长的影响。采用析因分析法评价T-cadherin联合氮烯咪胺对细胞活性、迁移和小鼠皮下瘤生长的影响。结果DTIC-R B16F10组、B16F10组与DTIC-R B16F10+DTIC组A值差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学检测表明细胞表达T-cadherin。T-cadherin联合DTIC组细胞活性、迁移细胞数及肿瘤重量均显著低于其他组(P<0.05)。析因分析显示,T-cadherin联合氮烯咪胺对DTIC-R B16F10的细胞活性、迁移和小鼠皮下瘤生长的抑制有协同作用。结论T-cadherin可抑制黑素瘤小鼠皮下瘤的生长,增加黑素瘤对氮烯咪胺的敏感性。     

槲皮素对鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶的影响

槲皮素（3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮）是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于多种蔬菜、水果和植物中,是人们饮食中不可缺少的成分之一。近年来对它的研究日益增多,发现其具有多种生物活性,诸如抗氧化和降低血压、改善心肌缺血再灌注损伤、增强免疫功能,以及抗菌、抗病毒等作用。笔者主要观察槲皮素对小鼠B16黑素瘤细胞黑素合成的影响,以及经槲皮素作用后B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）的合成和活性。     

白藜芦醇对人A375及鼠B16F10黑素瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对人A375及鼠B16F10黑素瘤细胞增殖及凋亡的调节作用.方法:利用体外细胞培养技术、MTT法、流式细胞仪、光学显微镜技术,检测不同浓度的Res对人A375及鼠B16F10细胞增殖及凋亡的影响.结果:Res对人A375及鼠B16F10细胞均有显著的增殖抑制作用,呈剂量效应依赖性关系.结论:Res在体外可抑制恶性黑素瘤(MM)细胞的增殖.     

二甲双胍和顺铂联用对B16F10黑素瘤细胞的协同抑制效应

目的探讨二甲双胍和顺铂联合用药对B16F10黑素瘤细胞的影响。方法体外培养黑素瘤细胞株B16F10,并用一定浓度的二甲双胍和顺铂处理肿瘤细胞。采用MTT法检测肿瘤细胞活性,并用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果 MTT结果表明,二甲双胍顺铂联用组细胞活性显著低于药物单用组(P0.05),二甲双胍顺铂存在对肿瘤的协同抑制作用(CDI1);流式细胞术结果表明,二甲双胍顺铂联用组的凋亡细胞比率(23.21±4.11)%明显高于空白对照组(1.21±0.12)%、二甲双胍组(2.32±0.16)%及顺铂组(14.12±1.78)%(P0.05)。结论二甲双胍与顺铂具有协同抑制黑素瘤生长的作用,并且和凋亡诱导效应的增强相关。     

黑素瘤B16-F1体外诱导淋巴管增生的研究

目的诱导建立小鼠淋巴管内皮细胞构成的良性肿瘤模型,观察小鼠黑素瘤细胞系B16F1体外对淋巴管增生的影响。方法8周龄C57BL/6小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂,对诱导出的小鼠腹腔淋巴管瘤进行病理组织学观察,用免疫组化方法检测淋巴管内皮细胞标志性抗原VEGFC和Flt4。分离、分切肿物后,于纤维蛋白凝胶内用B16F1细胞条件培养液培养,倒置显微镜下观察。结果实验小鼠中膈肌腹腔面、肝脏表面及侧腹壁腹腔面可见边界清楚的散在分布白色肿瘤样组织,常规和超微病理发现为由内皮细胞构成的多管腔囊性结构,并表达淋巴管内皮细胞标志性抗原VEGFC和Flt4。倒置显微镜下可观察到从淋巴管瘤块长入纤维蛋白凝胶内的微淋巴管,B16F1细胞条件培养液可促进淋巴管的生成。结论小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂可稳定诱导小鼠腹腔淋巴管瘤,B16F1细胞对淋巴管的生成有促进作用,黑素瘤的转移与淋巴管生成的关系有必要进一步研究。     

卡泊三醇对小鼠黑素瘤B16细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨不同浓度卡泊三醇(CPT)对小鼠黑素瘤B16细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度CPT作用于体外培养的小鼠黑素瘤B16细胞24h,在倒置显微镜下观察细胞密度及形态,采用MTT比色法和AnnexinV/PI染色法分别检测细胞增殖抑制率和凋亡率。结果与对照组相比,CPT浓度为1,10μg/mL组中B16细胞密度及形态无明显变化,也无增殖抑制作用(P>0.05)。而当CPT为102,103μg/mL时,细胞密度减少,形态由多角形变为略圆钝,甚至皱缩,对细胞增殖呈剂量依赖性的抑制作用(P<0.05)。CPT为1,10,102μg/mL时对B16细胞无凋亡诱导作用(P>0.05),而103μg/mL时则明显促进细胞凋亡(19.17±0.31)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CPT≤10μg/mL对B16细胞密度形态、增殖抑制率和凋亡率无明显影响;CPT≥102μg/mL能改变B16细胞形态,并呈浓度依赖性地抑制其增殖;而当CPT≥103μg/mL时能诱导B16细胞凋亡。     

小鼠触须毛囊体外培养的研究

目的 为了建立较理想的小鼠触须毛囊体外培养模型,对不鼠触须毛囊体外培养方法进行了研究。方法 通过小鼠触须毛囊体外无血清培养基的方法,对不同鼠龄及不同生长周期的毛囊进行了研究。结果 ①毛囊在Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｅ加Ｌ－谷酰胺培养基上生长平均达８天;②通过对比不同阶段的生长期毛囊发现生长期－Ⅱ毛囊生长力明显优于其它各期毛囊;③对不同鼠龄毛囊体外增培养生长状况的研究发现出生３５天和６５天鼠优于出生７天乳鼠     

CLEC2B基因过表达的Jurkat细胞培养上清液对黑素瘤细胞B16的影响

目的将CLEC2B基因过表达的Jurkat细胞培养上清液作用于黑素瘤细胞,观察其上清液对黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成的影响,探讨CLEC2B基因在白癜风发病中的作用。方法培养人淋巴瘤细胞Jurkat细胞和小鼠黑素瘤细胞B16,采用脂质体介导的方法瞬时转染CLEC2B重组质粒入Jurkat细胞,半定量RT-PCR法鉴定CLEC2B基因过表达;将其细胞培养上清液作用于黑素瘤细胞48 h后,MTT法检测黑素瘤细胞的增殖情况,多巴氧化法检测酪氨酸酶活性,氢氧化钠裂解法检测黑素含量。结果 CLEC2B基因过表达的Jurkat细胞培养上清液作用后的黑素瘤细胞增殖比空载体组、正常对照组降低,差异有统计学意义(均P0.05),CLEC2B过表达组黑素含量比空载体组、正常对照组减少,差异有统计学意义(均P0.05),CLEC2B过表达组、空载体组、正常对照组之间的酪氨酸酶活性比较差异无统计学意义(均P0.05),空载体组与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P0.05)。结论 CLEC2B基因过表达的Jurkat细胞培养上清液对黑素细胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用,对酪氨酸酶活性影响不明显。提示CLEC2B可能通过调节淋巴细胞功能间接影响黑素细胞增殖和黑素合成,从而参与白癜风发病。     

Ginsenoside F1 attenuates hyperpigmentation in B16F10 melanoma cells by inducing dendrite retraction and activating Rho signalling

Ginsenoside F1 (GF1) is a metabolite produced by hydrolysis of the ginsenoside Re and Rg1 in Panax ginseng. According to various studies, high amounts of ginseng components are absorbed in the metabolized form, which are key constituents responsible for the biological effects of P. ginseng. Recently, GF1 was reported to have beneficial effects on skin. However, there has not been a sound understanding of its antimelanogenic effect and underlying molecular mechanisms. In this study, GF1 reduced α‐melanocyte‐stimulating hormone‐induced melanin secretion in B16F10 cell culture media by 60%. However, it did not suppress intracellular melanin levels, tyrosinase activity and expression. Immunofluorescence assay showed that GF1 had no effect on melanosome transport, but significantly induced dendrite retraction. Pull‐down assay demonstrated that GF1 primarily modulates the Rho family GTPases resulting in dendrite retraction. Collectively, these data suggest that GF1 could act as a potent skin‐whitening agent.     

大黄素对黑素瘤B16F10细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的：明确大黄素对黑素瘤B16F10细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法：10、20、40、60、80 μmol/L的大黄素作用于B16F10细胞24 h后，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法检测细胞增殖；倒置显微镜下观察细胞形态及数目变化；细胞划痕实验和Transwell迁移实验分别检测各组细胞划痕愈合率和细胞迁移数目；流式细胞术检测细胞周期；TUNEL法检测细胞凋亡情况；Western blot测定凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果：与空白对照组比较，不同浓度（10、20、40、60、80 μmol/L）的大黄素均可抑制B16F10细胞的增殖（P＜0.05），其抑制率呈浓度依赖和时间依赖关系，并且将细胞阻滞于G2/M期。在显微镜观察下细胞呈现出凋亡状态，不同浓度的大黄素组凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平升高。结论：大黄素可有效抑制黑素瘤B16F10细胞增殖，抑制细胞迁移能力，并能促进细胞凋亡。     

Tumor apoptosis by indole-3-acetic acid/light in B16F10 melanoma-implanted nude mice

Recently, we reported that UVB-activated indole-3-acetic acid (IAA) induces the apoptosis of G361 human melanoma cells. In the present study, we used IAA and visible light combinations to treat B16F10 melanoma-implanted nude mice using an experimental intense pulsed light (IPL) therapy model. We first investigated whether activated IAA by horseradish peroxidase (HRP) or UVB causes apoptosis of B16F10 melanoma cells. IAA/HRP or IAA/UVB combination lead to apoptosis of B16F10 cells, as reported in other cell lines. Interestingly, IAA alone was not cytotoxic. These findings suggested the potential use of IAA in the treatment of melanoma. For the future clinical use, we also tested whether visible light has the same effects like UVB and found that visible light also activates IAA to produce free radicals and that IAA/visible light decreased cell viability significantly. Based on these results, IAA/IPL combination was tried whether it can induce apoptosis in vivo status. TUNEL staining showed that IAA/IPL treatment induced apoptosis of tumor cells. In addition, the expressions of p53, Fas, and PARP were upregulated in the IAA/IPL-treated group than in untreated control, demonstrating that IAA/IPL treatment caused apoptosis in melanoma-implanted nude mice. In conclusion, we showed that IAA/IPL induces melanoma regression in B16F10 melanoma-implanted nude mice. These results suggest the potential use of IAA/IPL in the treatment of malignant melanoma.