Bcl2及Bak1重组表达腺病毒对MG63细胞的影响

目的研究Bcl2、Bak1重组表达腺病毒载体单独或共转染对MG63细胞活性及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法收集对数期MG63细胞,分为4组:A组:空载腺病毒干预组;B组:Bcl2重组表达腺病毒转染组;C组:Bak1重组表达腺病毒转染组;D组:Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染组。A组给予空载腺病毒转染,B、C组分别给予Bcl2重组表达腺病毒、Bak1重组表达腺病毒转染,D组给予Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染,MTT法检测细胞活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性检测试剂盒检测ALP活性,流式细胞仪检测钙离子浓度,Western Blot检测CTGF、Runx2、OPN、TNF-α的表达。结果与A组相比,B组细胞活性、ALP活性升高,钙离子浓度降低,CTGF、OPN、Runx2蛋白相对表达量均升高,TNF-α表达量则降低,差异有统计学意义(P0.05);C组细胞活性、ALP活性降低,钙离子浓度升高,各蛋白相对表达趋势与B组相反,差异有统计学意义(P0.05);D组细胞活性、ALP活性、钙离子浓度升高,CTGF、Runx2相对表达量升高,OPN、TNF-α相对表达量降低,但差异均无统计学意义(P0.05)。(2)B组、C组、D组各检测指标组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Bcl2重组表达腺病毒载体转染MG63细胞可增强细胞活性及钙化能力,促进骨形成。     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的构建携载大鼠弹力蛋白原（tropoelastin）基因的重组腺病毒载体，并在体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）中表达。方法利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pShuttleTropoelastin-GFP进行同源重组，筛选出重组黏粒pAdTropoelas-tin-GFP，经过包装、扩增、纯化后获得重组腺病毒AdTropoelasfin-GFP，测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞，一步法提取细胞总RNA，逆转录后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）检测tropoelastin的mRNA。结果得到了携载tropoelastin基因的重组腺病毒，纯化后滴度为5×10^11pfu／ml，腺病毒转染VSMC后1、3dtropoelastinmRNA表达较空病毒明显增高（P〈0．01），并超出空病毒转染组2倍以上。结论成功构建了携带tropoelastin的重组腺病毒载体，体外转染的VSMC有效表达目的基因。     

重组腺病毒介导的野生型p53基因对结直肠癌细胞的放射治疗增敏作用

目的探讨野生型p53基因通过重组腺病毒转染至结直肠癌细胞后对放射治疗（放疗）的增敏作用。方法将含野生型p53基因的重组腺病毒转染SW480结直肠癌细胞后,采用4、6Gy对其进行放疗。并通过噻唑蓝比色法检测生长抑制率、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记检测细胞凋亡水平、免疫组化检测增殖细胞核抗原的表达。结果经4、6Gy放疗后,转染野生型p53基因的SW480细胞生长受到了明显的抑制（P〈0．05）,凋亡率增加,增殖细胞核抗原比率下降。结论野生型p53基因可增加p53突变的结直肠癌细胞对放射治疗的敏感性。     

p53重组腺病毒联合顺铂或三氧化二砷对人膀胱癌EJ细胞的作用

目的：探讨p53重组腺病毒（Ad-p53）与顺铂（CDDP）或三氧化二砷（As2O3）联合应用提高膀胱癌疗效的可能性及其机制。方法：将Ad-p53[100感染强度（MOI）]与CDDP（0．5mg/L)或As2O3(2.0μmol/L）联合应用，通过细胞生长抑制实验、克隆形成实验、细胞周期分析、免疫组织化学分析以及裸鼠皮下移植瘤模型，观察其对膀胱癌EJ细胞的作用及机制。结果：与单独应用相比，Ad-p53与低剂量的CDDP或As2O3联合可明显抑制EJ细胞体外生长，诱导EJ细胞凋亡，EJ细胞G2／M期阻滞更明显；裸鼠体内肿瘤发生时间延迟，4周后肿瘤体积与单独应用时相比，差异有显著性（P＜0．05）。结论：基因治疗与化疗联合应用，可进一步提高膀胱癌的疗效。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

重组蛋白sCAR-TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

目的 提高腺病毒(adenovirus,ADV)在缺乏柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)的骨肉瘤细胞中的转染效率.方法 通过昆虫(Bac-to-Bac)杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段(sCAR)及TMTP1肽的重组蛋白(sCAR-TMTP1),并对其纯化、鉴定.流式细胞仪分别检测骨肉瘤细胞及人胚肾细胞293(HEK293)的CAR表达水平,ADV对其的感染效率及FITC-TMTP1的结合能力.重组蛋白sCAR-TMTP1与ADV共同孵育形成复合物,流式细胞仪研究其在缺乏CAR的骨肉瘤细胞(MG-63)中的转染效率.结果 表达及纯化的sCAR-TMTP1蛋白在相对分子质量约31000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠sCAR单克隆抗体发生特异性反应.MG-63可与FITC-TMTP1特异结合,其CAR表达水平低,ADV转染效率低.经sCAR-TMTP1修饰后的ADV/GFP对MG-63细胞的感染效率显著高于未经修饰的含报告基因GFP的ADV(ADV/GFP).结论 重组蛋白sCAR-TM-TP1可显著提升ADV对缺乏CAR的骨肉瘤细胞的转染效率.     

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。     

NF-κBp50基因缺失对小鼠实验性急性胰腺炎的影响

目的:实验诱导急性胰腺炎,观察p50基因敲除小鼠胰腺组织结构和功能的变化,探讨NF-κB在急性胰腺炎病理过程中的作用。方法:蛙皮素诱导建立野生小鼠和p50基因敲除小鼠的胰腺炎动物模型,检测各组小鼠p50、p65和cRel蛋白的表达情况,NF-κB DNA结合活性,血清淀粉酶和脂肪酶水平,胰腺组织的细胞坏死和凋亡情况和胰蛋白酶活性。结果:p50基因敲除小鼠缺乏p50蛋白表达,但p65和cRel蛋白代偿性增加。同野生型小鼠相比,p50基因敲除小鼠在发生急性胰腺炎时,NF-κB活性降低、细胞凋亡增加、细胞坏死减少,血清淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性下降。结论:p50基因缺失后,NF-κB的其他亚单位蛋白表达代偿性增加;NF-κB对胰腺细胞坏死和凋亡有重要的调节作用,能减轻急性胰腺炎的病情。     

人尿激酶型纤溶酶原激活物重组腺病毒对大鼠肝纤维化的影响

目的 观察携带人非分泌型尿激酶型纤溶酶原激活物cDNA的复制缺陷型腺病毒pAd-△uPA对大鼠肝纤维化的影响。方法 运用DNA重组技术,构建携带人非分泌型尿激酶型纤溶酶原激活物cDNA的复制缺陷型腺病毒pAd-△uPA,通过门静脉注射将其导入大鼠肝纤维化模型体内;通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR),Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组织化学以及Von Gieson胶原染色法观察腺病毒pAd-△uPA对大鼠肝纤维化的影响。结果pAd-△uPA可在大鼠肝脏中表达,其表达产物可促进肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解(P<0.05),但对病理形态学的影响尚不显著(P>0.05)。结论腺病毒pAd-△uPA可促进肝纤维化肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解。     

A simple quality control protocol for haemoximetry using standard p50

We have designed a quality control tool for haemoximetry using the principle that standard p 50, calculated from blood gas and haemoximetry measurements using the Siggaard-Andersen algorithm, remains unchanged when a specimen of venous blood is oxygenated progressively to 97% saturation of haemoglobin. If the haemoximeter is inaccurate, progressively larger deviations of standard p 50 from the constant value occur above 80% saturation. Deviations too small to be detected by analysis of quality control materials comprised of non-haemoglobin dyes and yet sufficient to cause significant errors in derived extractivity parameters can be detected by this method.
The suggested protocol is easy to perform, and is recommended as a quality control tool for blood gas analyser/haemoximeters used to determine arterial extractivity parameters.     

Evaluation of two methods to calculate p50 from a single blood sample

BACKGROUND: The hemoglobin-oxygen affinity is conveniently described as the oxygen tension at which the hemoglobin is 50% saturated (p50). We compared two methods of single-point analysis for p50 calculation, using clinical data. METHODS: From patients submitted to anesthesia for major surgery, 114 arterial or venous blood samples were analyzed by using the Sigaard-Andersen oxygen status algorithm (p50OSA) and Doyle's method (p50Doyle) based on Hill's equation. RESULTS: The oxygen saturation and tension varied respectively between 0.64-0.96 and 3.8 kPa-11.0 kPa. A Bland-Altman analysis showed a mean difference of 0.04 kPa (SD 0.12 kPa). The limits of agreement were -0.20 kPa and +0.28 kPa. CONCLUSIONS: The Siggaard-Andersen oxygen status algorithm is presently the most clinically useful single-point method of p50 calculation.     

HLA-E�������������幹�������ڸΰ�HepG2ϸ���еı��

目的 构建表达人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导HLA-E基因在肿瘤免疫中的意义.方法 2006年10月至2007年11月在中山大学附属第三医院肝移植中心应用pGC-El-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞,检测慢病毒载体的转导效率、细胞内HLA-E信使核糖核酸(mRNA)及蛋白质水平的表达.结果 pGC-El-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞72h的转导效率为(95.0±1.3)%;通过RT-PCR检测24h后细胞内HLA-E mRNA水平是肝癌HepG2细胞的(8.73±1.05)倍,72h后为(293.48±42.01)倍,差异具有统计学意义(P<0.01).细胞免疫组化显示转导HLA-E后细胞内的蛋白水平明显增强.结论 慢病毒栽体系统能够使转导的基因在靶细胞中得到稳定表达,是基因治疗中的理想载体.     

腺病毒介导p53基因对胰腺癌细胞抑制作用的体外实验研究

目的 探讨腺病毒介导p53基因(adenovirus-mediated p53 gene,Ad-p53)对人胰腺癌细胞株PANC-1的生长抑制作用.方法 以Western Blot方法 检测加入Ad-p53后PANC-1细胞在48h 、72h p53表达情况以及未处理组细胞48h 、72h p53的表达.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测不同MOI值的Ad-p53感染后,PANC-1细胞的生长情况并绘制生长曲线,用PI、annexin V-FITC双重染色并用流式细胞技术检测受感染细胞的凋亡比例.结果 Western Blot结果 显示,处理组细胞内48h 、72h p53蛋白表达明显高于相同时间点对照组细胞;MTT结果 显示不同MOI值细胞生长抑制情况不同,MOI值越高,对细胞生长的抑制程度也越高;流式检测细胞在MOI值为150时,0h、48h、72h凋亡比例分别为(7.5±0.8)%、(22.5±2.3)%和(34.4±2.7)%,对照组细胞为(5.8±0.4)%、(8.3±1.7)%和(9.7±2.1)%.结论 Ad-p53能有效感染胰腺癌细胞,导致胰腺癌细胞凋亡.     

野生型p53基因对不同内源性p53状态的肝癌细胞株生长的影响

目的探讨外源性野生型p53(wild-type p53,WT-p53)基因对具有不同内源性p53功能状态肝癌细胞生长的影响.方法通过表达WT-p53的重组腺病毒载体(Ad-p53),将p53基因导入具有不同内源性p53功能状态的肝癌细胞株Bel-7402、QGY-7701和PLC/PRF/5中,用MTT法检测Ad-p53对各细胞株生长的影响,流式细胞仪分析各组细胞中DNA含量及凋亡的比例.结果当取40、200、800 MOI值的表达p53的腺病毒分别转染PLC/PRF/5、Bel-7402和QGY-7701细胞时,72 h后行MTT检测,OD值分别为在 PLC/PRF/5细胞,空载体(Ad-LacZ)组0.98±0.16,Ad-p53组0.02±0.00(P＜0.01);在Bel-7402细胞Ad-LacZ组1.04±0.23,Ad-p53组0.10±0.02(P＜0.01);而在QGY-7701细胞Ad-LacZ组1.88±0.24,Ad-p53组1.86±0.19(P>0.05).细胞周期分析显示,在PLC/PRF/5,表现为既诱导细胞凋亡,又诱导细胞周期阻滞.在Bel-7402,表现为诱导细胞周期阻滞.结论外源性p53对肝癌细胞生长的抑制可能与内源性p53功能状态无关.     

Wnt-1重组腺病毒的构建及其对人表皮干细胞分化的影响

目的 构建Wnt-1重组腺病毒,并观察Wnt-1对人表皮干细胞分化相关蛋白表达的影响.方法 连接穿梭质粒与骨架质粒,构建重组腺病毒;扩增后感染人表皮干细胞,检测其3种角蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达.结果 重组质粒酶切后可得到30 kb和4.5 kb两条特异性条带;人表皮干细胞感染重组腺病毒后,聚合酶链反应(PCR)与绿色荧光蛋白均指示Wnt-1基因的表达,且角蛋白10表达变为阳性;角蛋白18表达增强;角蛋白19表达减弱;细胞培养基中MMP-2浓度由(-16.25±2.40)μg/L升高至(714.88±30.45)μg/L(t=58.45,P<0.01).结论 Wnt-1具有促使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的趋势.     

ATP50荧光表达载体构建及其在TM3小鼠睾丸Leydig细胞定位研究

目的:构建ATP50的荧光表达载体,研究其在原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达和在TM3小鼠睾丸Leyd ig细胞中的定位。方法:原代培养小鼠睾丸Leyd ig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究ATP50在小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达。利用BamH I和EcoR I酶切位点把ATP50克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-ATP50在TM3小鼠睾丸Leydig细胞的定位。结果:ATP50表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,绿色荧光的YFP-ATP50和红色荧光的线粒体标记物M ito-tracker有完全的共定位。结论:ATP50在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建了ATP50真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-ATP50定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞睾酮合成功能障碍的研究提供重要的信息,有利于进一步深入研究。     

重组人腺病毒p53对裸鼠人胃癌细胞移植瘤的抑制效果及不良反应

目的 探讨重组人腺病毒p53(rAd-p53)对胃癌细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应及相关不良反应.方法 将胃癌细胞SGC-7901注射于裸鼠皮下制成动物模型,分别用rAd-p53和盐酸表阿霉素(EPI)进行治疗.rAd-p53治疗组剂量为10μl浓度1012vp/ml,EPI治疗组剂量为1.25mg/kg,各组每3周给药7次,以生理盐水为对照组.结果 与对照组比较,rAd-p53治疗组和EPI治疗组肿瘤抑制率分别为80％和60％,差异有统计学意义(P＜0.01);rAd-p53和EPI治疗组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).没有实验动物死亡,rAd-p53治疗组2只裸鼠出现肝脏不良反应,EPI治疗组1只裸鼠心脏不良反应,上述反应均有病理学观察证实.结论 裸鼠体内实验证实rAd-p53对胃癌细胞具有抗肿瘤效应,但应注意其肝脏不良反应.