改良墨汁明胶灌注法与胶原蛋白酶消化法在大鼠视网膜新生血管形态显示中的对比研究

目的　比较改良墨汁明胶灌注法与胶原蛋白酶消化法对大鼠视网膜新生血管形态显示的不同。方法　将鼠龄为７ｄ的ＳＤ大鼠１２只（２４眼）随机分成墨汁明胶灌注组（ｎ＝６）和胶原蛋白酶消化组（ｎ＝６）,两组大鼠共同暴露于含体积分数８０％ ±２％氧浓度环境饲养５ｄ,然后回到正常氧环境饲养５ｄ。在第１８天时将一组幼鼠行心脏墨汁明胶灌注,另一组采用胶原酶消化法。取两侧眼球,一眼用于视网膜铺片,另一眼行组织切片观察突破内界膜的血管内皮细胞核数目,证实新生血管的增殖。部分切片做血管性血友病因子免疫组织化学染色。结果　改良墨汁明胶灌注法能很好显示大鼠视网膜新生血管。胶原蛋白酶消化法技术复杂,成片率低;联合共聚焦显微镜可以进行视网膜新生血管的三维结构观察。结论　改良墨汁明胶灌注显示大鼠视网膜新生血管优于胶原蛋白酶消化法,适宜广泛使用。     

小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨

保持原有的形态;C组视网膜黏附黑色视网膜色素上皮层,不易分离.荧光显微镜下照相观察:A组铺片成功率为30%,视网膜血管变形,模糊不清;B组铺片成功率为90%,视网膜血管均匀规则分布;C组铺片成功率为30%,黑色视网膜色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀.结论 良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键.     

完整视网膜毛细血管网消化铺片技术及细胞计数方法的改进

背景 以往视网膜血管消化铺片法仅能够获得部分视网膜血管,无法客观评价全视网膜血管的病理改变,因此进一步获得完整的视网膜血管网是相关疾病实验研究和临床研究的基础. 目的 在国外对全视网膜血管消化铺片技术的基础上进行改良,建立全视网膜血管的铺片方法. 方法 30只健康Wistar 大鼠随机数字表法分为模型组和对照组,模型组20只大鼠用溶于0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液的质量分数1.25％链脲佐菌素（STZ）腹腔内注射法制作糖尿病模型,对照组10只大鼠以同样的方法注射等容量柠檬酸缓冲液.注射后8个月经左心室注射PBS 100 ml,剪开右心房使血液及PBS流出后注射质量分数4％多聚甲醛100 ml,摘除眼球,将完整剥离的大鼠视网膜先进行胰蛋白酶消化,然后剥离玻璃体及内界膜,去除视网膜神经组织,得到完整的视网膜毛细血管网,平铺于载玻片上,将视网膜毛细血管网以视盘为中心划为内、中、外3个区域,采用盲法在光学显微镜下判定和计数中间区域影周细胞及无细胞血管. 结果 视网膜铺片显示,大鼠的视网膜血管为全血管型,可见放射状的视网膜中央动脉与视网膜中央静脉主干及逐级分支结构、小动脉与小静脉之间表浅层和深层的毛细血管网.周细胞略突出于血管管壁,在其形成影周细胞时,原有的细胞核缺失.无细胞血管的管径为邻近毛细血管管径的20％以上,并且在整个血管上无细胞核和影周细胞.结论 全视网膜消化铺片技术能够提供实验所需的完整视网膜毛细血管网,配合细胞计数方法,能够较好地评价视网膜的形态改变,并为视网膜血管和管壁细胞的定量分析提供有利条件.     

视网膜血管铺片技术的改进及在糖尿病视网膜病研究中的运用

目的：改进视网膜血管铺片的制备方法，并用于糖尿病视网膜病的研究。 方法：分别用胰蛋白酶消化法及胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片，比较铺片成功率。一次性腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型，成模13wk时以胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片，行HE染色观察血管形态改变，免疫组织化学染色方法观察RAGE、ICAM-1的表达。 结果：胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法较胰蛋白酶消化组铺片成功率高（80％vs53．3％，P〈0．05），能显示清晰、完整的视网膜血管网。糖尿病大鼠视网膜无细胞毛细血管较正常大鼠增加2．67倍，毛细血管RAGE及ICAM-1免疫活性分别上调1．26倍，1．43倍（P〈0．001）。 结论：胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法是一种稳定的重复性好的视网膜血管铺片技术，可用于糖尿病视网膜病变的研究。     

改良视网膜铺片联合免疫荧光染色技术在氧诱导视网膜病变模型中的应用

背景 氧诱导视网膜病变(OIR)动物模型的视网膜铺片是缺血性视网膜病变研究的有用工具.OIR大鼠或小鼠的幼鼠视网膜面积小且厚,采用传统方法先剪开视网膜再进行铺片实际操作难度较大,影响了对实验结果的定量分析. 目的 探讨一种易操作、稳定性好的鼠视网膜铺片联合免疫荧光染色技术.方法采用随机数字表法将40只出生后＜6 h的SD大鼠随机分为OIR模型组和正常对照组,OIR模型组幼鼠与母鼠一起以24 h的时间间隔交替在体积分数80％高氧环境或21％常氧环境中喂养14d,正常对照组大鼠在常氧环境中喂养.于喂养至14 d时摘除眼球并剥离视网膜,对完整的视网膜先行谷氨酰胺合成酶(GS)-isolectin B4染色,然后展平视网膜铺片并呈放射状切为4瓣,并于荧光显微镜下拍照,应用Adobe PhotoshopCS3图像分析软件系统进行图像拼接处理,获得全视网膜血管图像,采用软件测量每张完整视网膜铺片图像中无血管区及整个视网膜的像素值,最后计算无血管区的像素百分比进行无灌注区严重程度分析. 结果采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法可见视网膜结构完整,展开的视网膜铺片平整,视网膜全周均可见锯齿缘结构.视网膜血管呈强的绿色荧光,血管分支清晰可见,而视网膜的背景绿色荧光较弱.正常对照组大鼠视网膜铺片显示其血管基本发育完全,OIR模型组大鼠视网膜铺片可显示中央视盘旁无毛细血管区及周边大片无血管区形成. 结论 采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法制备视网膜铺片简便、易行,较传统的视网膜铺片法更容易确保视网膜结构的完整性,有利于OIR模型视网膜血管形态学的观察和分析.     

视网膜消化铺片的免疫荧光染色探讨

目的：探讨视网膜消化铺片联合免疫荧光染色技术的可行性。方法：正常Wistar大鼠和链尿佐菌素（Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病2周大鼠各5只。经心脏灌注后，取右眼视网膜作胰酶消化铺片，并在铺片上进行血管细胞粘附分子－1（Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)单克隆抗体免疫荧光染色。结果；大鼠视网膜消化铺片可以清晰看到视网膜血管走行、分布、正常大鼠未见VCAM－1阳性表达，糖尿病2周组视网膜血管壁见VCAM－1阳性细胞表达。结论：视网膜血管铺片联合免疫荧光染色技术是可行的。     

四种大鼠视网膜固定方法对冰冻切片制作的影响

背景视网膜的组织病理学检查是眼科基础研究和临床检查的重要方法,不同的固定方法对视网膜的组织结构和检查结果产生重大影响。目前国内制备视网膜切片时多采用前固定法,而国外多采用后固定法,国内缺少对不同的固定方法比较的研究。目的对4种不同固定方法制作的大鼠视网膜组织冰冻切片进行比较,确定更简单、有效的视网膜组织病理学切片制备方法。方法将40只大鼠按照随机数字表法分为长时多聚甲醛组（质量分数4％多聚甲醛固定过夜,n=10）、短时多聚甲醛组（4％多聚甲醛固定2～3h,n=10）、甲醛一冰醋酸一乙醇（FAA）组（FAA混合固定液固定,n=10）和冷丙酮组（冷丙酮后固定,n=10）。迅速摘除眼球后,将长时和短时多聚甲醛组分别置入4％多聚甲醛中,FAA组置入FFA混合固定液中固定相应时间,然后进行OCT包埋和切片,而冷丙酮组则先进行液氮速冻和OCT包埋,然后在冷丙酮中固定,切片。4个组大鼠眼杯均行苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察各组视网膜组织形态。结果在4种视网膜固定方法中,长时多聚甲醛组视网膜结构疏松,内核层（INL）和外核层（ONL）细胞堆积;短时多聚甲醛组大鼠视网膜层间排列较疏松,但INL和ONL细胞排列较长时多聚甲醛组规则;FAA组大鼠视网膜结构排列较紧密;冷丙酮组大鼠视网膜各层次结构清晰,组织完整,ONL、INL和神经节细胞层（GCL）细胞排列规则,形态接近正常活体组织。结论在视网膜组织病理学检查中,前固定法制备的视网膜切片对组织形态影响较大,直接液氮速冻法（后固定法）是一种简单、省时且不影响组织形态的方法。     

小鼠视网膜新生血管模型荧光素灌注造影

目的探讨使用一种具有较高相对分子质量的荧光素进行灌注造影,使小鼠视网膜新生血管模型眼底血管显影的可行性。方法向高氧诱导的视网膜新生血管模型小鼠心脏灌注具有较高相对分子质量的荧光素,眼球经过短暂固定后,通过显微手术镜游离视网膜并铺片,在荧光显微镜下观察视网膜血管的分布与形态。结果在荧光显微镜下清楚地观察到全视网膜血管形态、走行;通过调节焦点,使视网膜浅层、深层以及二者交通支都清晰显影。高氧诱导的视网膜新生血管主要发生在视网膜有血管区与无血管区的交界部位,可见渗出、出血、微血管瘤的表现。方法简便、快捷,重复性好。结论通过这种方法可以清晰、准确地动态了解视网膜新生血管模型小鼠眼底血管的病变部位及形态学改变。采用此种具有较高相对分子质量的荧光素进行灌注造影可以较好地应用于视网膜新生血管性疾病的基础研究。     

两种检测小鼠氧诱导视网膜新生血管方法的比较

目的比较异凝集素视网膜铺片染色和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片两种方法检测氧诱导视网膜病变(OIR)新生血管的优缺点,探讨视网膜新生血管染色方法的合理选择。设计实验研究。研究对象C57BL/6J乳鼠OIR模型8只,正常对照8只。方法 OIR组和正常对照组各4只鼠视网膜铺片异凝集素染色,各4只鼠硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片。3位观察者盲法利用图像分析软件计算视网膜铺片上视网膜血管无灌注区和新生血管面积。主要指标不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积的一致性(α值)。结果异凝集素染色视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.858、0.959;硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片上,不同观察者计算的视网膜新生血管及无灌注区面积α值分别为0.626、0.972。结论利用OIR模型研究视网膜新生血管时,异凝集素染色视网膜铺片和硫氰酸葡聚糖荧光素心脏灌注视网膜铺片均能清晰显示新生血管和无灌注区,前者在量化视网膜新生血管和无灌注区面积时均较可靠,而后者只适合于评价视网膜新生血管的灌注情况。     

糖尿病视网膜病变模型鼠品系的选择

背景链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病大鼠模型是目前公认的经典动物模型,常用于糖尿病视网膜病变（DR）的实验研究,但模型的制作多使用无色素大鼠的视网膜血管消化铺片技术,无法用荧光素眼底血管造影（FFA）进行活体动态观察,且实验中需要的动物数量较多。近年来有色素大鼠已逐渐用于制作DR模型,但采用活体动物FFA检测比较两种模型的研究较少。目的比较有色索大鼠和无色素大鼠糖尿病模型FFA和视网膜血管消化铺片的表现,选择适合活体监测视网膜血管改变的糖尿病模型大鼠品系。方法选择健康雄性Brown—Norway（BN）大鼠和Sprague—Dawley（SD）大鼠各15只,经尾静脉注射55mg／kg STZ制作1型糖尿病大鼠模型,注射后每周经鼠尾断端采血检测血糖,血糖值≥16．7mmol／L为造模成功。造模6周后选取大鼠右眼为实验眼,用裂隙灯显微镜观察模型鼠的眼前节变化,用眼底照相和FFA检查观察大鼠眼底血管变化,然后制备模型鼠离体视网膜血管消化铺片,过碘酸希夫染色后在光学显微镜下观察模型鼠视网膜血管的病理改变,比较2种不同品系大鼠视网膜血管在同样的病理改变下FFA的表现。结果造模后6周,共纳人造模成功的BN大鼠11只和SD大鼠10只,2种大鼠血糖分别为（24．73±2．98）mmol／L和（22．36±3．65）mmol／L,差异无统计学意义（t=7．873,P〉0．05）。BN大鼠组发生晶状体混浊者6眼,SD大鼠组5眼,差异无统计学意义（P=0．717）。FFA检查显示,BN大鼠组眼底在棕褐色背景下视网膜血管显影清晰,无脉络膜血管背景荧光干扰,9眼可见血管迂曲、荧光素渗漏等背景期糖尿病视网膜血管改变,而SD大鼠组由于脉络膜背景荧光和涡静脉的干扰,视网膜血管显影不清晰,未见背景期糖尿病视网膜血管改变。视网膜血管消化铺片显示,2种不同品系大鼠均被证实有视网膜毛细血管管径变化、周细胞数目的减少及血管内皮细胞数目的增加,BN大鼠组和SD大鼠组视网膜内皮细胞／周细胞（E／P）分别为11．50±3．68和12．86±3．94,差异无统计学意义（t=9．785,P〉0．05）。结论通过活体FFA观察,BN模型大鼠早期糖尿病视网膜血管改变的成像效果优于SD大鼠。     

糖尿病早期大鼠视网膜微血管改变的形态学研究

目的研究糖尿病早期大鼠视网膜微循环的形态学改变及白细胞在糖尿病视网膜病变（ｄｉａ－ｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＤＲ）微循环障碍中的作用。方法雄性成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠１２只，随机分为正常对照组、链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）糖尿病大鼠３、６个月组各４只。动物活体灌注固定，视网膜消化铺片，光镜观察，计数周细胞并行统计分析。结果糖尿病大鼠６个月组视网膜毛细血管周细胞数明显减少，并见毛细血管有白细胞栓塞。结论大鼠注射ＳＴＺ后６个月出现ＤＲ的早期改变，白细胞栓塞毛细血管形成ＤＲ微循环障碍。     

小鼠伊文思蓝尾静脉或腹腔注射及视网膜铺片技术的优化

目的:对小鼠伊文思蓝静脉推注联合视网膜铺片的技术进行优化,以提高视网膜铺片染色实验的准确性和可重复性。方法:C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射10g/L(1%)伊文思蓝0.3mL后体内分别循环10、20min,处死后摘取眼球,4%多聚甲醛分别固定20、40、60min,将不同体内循环时间及不同组织固定时间对于视网膜血管的走形、分布及渗漏的影响进行了优化比较。尾静脉注射失败后,通过腹腔注射1%伊文思蓝0.3mL,体内循环3h,固定60min进行补救,观察视网膜血管的走形、分布及渗漏。同时将尾静脉注射后视网膜血管的走形、分布及渗漏与腹腔注射后的结果进行效果比较,确定最佳的体内循环时间以及视网膜铺片的条件。结果:尾静脉注射后,与体内循环20min,固定20或40min条件下视网膜血管情况相比,伊文思蓝体内循环10min,固定60min,视网膜血管走行、血管分支清楚,血管渗漏较少。尾静脉注射失败后,腹腔注射补救措施结果显示视网膜血管走行、各级血管形态清晰。腹腔注射伊文思蓝体内循环3h与尾静脉注射伊文思蓝体内循环10min相比,视网膜血管的走形、分布的效果无明显差别。结论:优化伊文思蓝静脉推注联合...     

Confocal laser scanning fluorescence topography: a new method for three-dimensional functional imaging of vascular structures

Three-dimensional topography of perfused vascular structures is possible via confocal laser scanning of intravascular fluorescence. The lateral resolution is given by the spot size of the scanning laser beam (optimally 10 μm at the retina). The axial resolution, however, depends on the accuracy of detection of the surface of the fluorescent structure, which is typically one order of magnitude higher (30 μm at the retina) than the confocal resolution. The vascular structure is stained with an appropriate fluorescent dye prior to the investigation using standard systemic dye injection. Confocal scanning of the fluorescence in planes of different depths within the vascular structure under investigation leads to a three-dimensional data set. Signal processing includes passive eye tracking, lateral averaging and axial determination of the surface of the fluorescent structure. The potential of this new technique is demonstrated by showing the topography of physiological vessel structures as well as of selected vascular diseases such as cone dystrophy, RPE detachment, choroidal haemangioma and retinal laser coagulation. Confocal laser angioscopic fluorescence topography (CLAFT) measures the three- dimensional surface structure of functional (perfused) vasculature and surrounding leakage. CLAFT may help to diagnose and quantify status and time course of vascular diseases. Received: 2 March 1999 Revised: 15 June 1999 Accepted: 5 August 1999     

Visualization of retinal pigment epithelial cells in vivo using digital high-resolution confocal scanning laser ophthalmoscopy

PURPOSE: To visualize retinal pigment epithelial cells in vivo by fundus autofluorescence imaging using a confocal scanning laser ophthalmoscope. DESIGN: Experimental study and observational case report. METHODS: Digital in vivo autofluorescence images were recorded with a confocal scanning laser ophthalmoscope (excitation, 488 nm; emission, >500 nm) and compared with confocal scanning laser ophthalmoscope and fluorescence microscopic recordings from human donor eyes. RESULTS: A uniform pattern of the polygonal retinal pigment epithelial cell layer was visualized in vivo outside of absorbing retinal vessels and macular pigment. Autofluorescence intensities of individual cells showed marked variation. The pattern corresponded to in vitro findings. Visualization is based on the topographic distribution of autofluorescent lipofuscin granules and melanin granules in apical retinal pigment epithelium cytoplasm. CONCLUSIONS: High-resolution autofluorescence imaging may be useful to determine morphologic and lipofuscin-dependent alterations in retinal diseases and may be applicable for monitoring effects of therapeutic interventions targeting the retinal pigment epithelium.     

Localization of laminin to retinal vessels of the rat and mouse using whole mounts

Using a whole mount procedure in adult and neonatal mice and adult rats, we have developed an immunohistochemical method for the localization of laminin-like immunoreactivity (LLIR) to the retinal vessels. LLIR was localized to the vascular basement membrane, permitting a clear three-dimensional view of the retinal vasculature. Positive stain was seen in the inner limiting membrane, in retracted capillaries, encasing pericytes, and in a banding pattern on retinal arterioles. The major findings with the whole mount preparations were confirmed using paraffin-embedded material, with the additional observation of LLIR in the lens capsule. In whole mounts of retinas from neonatal mice, LLIR was present from the earliest stages of capillary growth, indicating that laminin is likely to be secreted by endothelial cells during retinal angiogenesis. LLIR within the retinal nerve fiber layer does not precede capillary ingrowth, so no evidence was found that laminin acts as a tracker signal for retinal angiogenesis.     

Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease

PURPOSE: Aberrant growth of blood vessels in the eye is a major cause of vision loss, occurring as a complication of diabetic retinopathy, age-related macular degeneration, and retinal vascular occlusions, among others. Whereas in humans, in vivo angiography is routinely used to image such diseases, many animal models of ocular vascular disease and development rely on dissected tissues that may not accurately represent in vivo conditions and require enucleation of the eye, the death of the animal, or both. METHODS: A method of three-dimensional imaging of blood vessels was used in the living mouse eye that involved scanning laser confocal microscopy and computer-aided image reconstruction. RESULTS: This minimally invasive technique was used to collect three-dimensional images of intraocular vessels in vivo during development. The retinal and choroidal vasculature was studied during development and disease, in models of retinal degeneration, central retinal vein occlusion, and oxygen-induced retinopathy. To aid in investigations into cell-based therapies for retinal disease, two-color imaging was used to localize transplanted cells in relation to the vasculature. This technique was used to perform serial imaging of the ocular vasculature over time, when developmental regression of vessels was observed. CONCLUSIONS: This in vivo vascular imaging approach is valuable in monitoring normal development, disease progression, and efficacy of experimental treatments in mouse models of ocular vascular disease and may have broader applications to the field of angiogenesis by using the readily visualized ocular vascular bed as a surrogate to test pro- and antiangiogenic compounds.