应用玻璃化冷冻技术保存人未成熟卵母细胞的研究

目的利用玻璃化冷冻保存技术合理利用常规促排卵周期获得的未成熟卵母细胞。方法1．对注射hCG后38h、43h、60h获得GV期卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,冻融后的未成熟卵母细胞行体外成熟培养（IVM）,用ICSI技术对获得的成熟卵母细胞完成授精,并体外胚胎培养至囊胚期。比较各组间的冻融存活率、体外成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。2．对GV卵分别行先玻璃化冻融后IVM和先IVM后玻璃化冻融,比较它们的冻融存活率、体外成熟率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果1．38h与43h卵龄GV卵在各项指标比较上没有差异,60h卵与前2组有相似的冻融存活率,但在体外成熟率、受精率和卵裂率上较前2组出现明显下降趋势。3组均无囊胚形成。2．先玻璃化冻融后IVM和先IVM后玻璃化冻融在未成熟卵母细胞的利用率上没有差异。结论1．冷冻卵龄较短的GV期卵母细胞能获得更好的冷冻保存效果。2．玻璃化冻融和IVM先后不影响未成熟卵母细胞的利用。     

人成熟卵母细胞玻璃化冷冻技术的临床应用

目的探讨玻璃化冷冻技术应用于人成熟卵母细胞冷冻保存的临床效果。方法使用开放式载体cryotop进行人成熟卵母细胞的玻璃化冻存,对10例患者的冷冻卵子复苏后进行卵母细胞浆内单精子（ICSI）注射后行胚胎移植,观察复苏卵母细胞受精、卵裂、胚胎发育及临床妊娠情况。结果 10例患者共86枚玻璃化冻存的成熟卵母细胞复苏后77枚存活,69枚正常受精,获得65枚胚胎,共移植17枚胚胎,3例患者获临床妊娠,其中2例双胎妊娠。结论玻璃化冷冻技术是有效地保存人成熟卵母细胞的方法,有一定的临床应用价值。     

生物活性产品玻璃化冷冻保存研究进展

综述了有关动物细胞、胚胎、组织、器官和工程化组织的玻璃化冷冻保存问题。对玻璃化冻存技术基本原理及其在生物产品保存中的冷冻、复温方法,玻璃化液的组成、作用及其对保存产品的影响等进行了阐述。指出玻璃化冷冻保存可能是长时间保存有活性的生物产品简单、适用、有效的方法。同时指出玻璃化冷冻保存方法面临的问题及发展的方向。     

人卵母细胞冷冻保存的初步研究

目的比较慢速冷冻、冷冻环和自制叶片2种不同载体玻璃化冷冻应用于人卵母细胞冷冻保存的效果。方法经患者本人同意和伦理委员会的批准,收集未成熟的MI期卵,体外自然成熟后冷冻保存,解冻121个卵,存活卵用ICSI方法受精,比较慢速冷冻、玻璃化冷冻（冷冻环和自制叶片2种载体）在存活率、受精率、卵裂率、优质胚胎率方面的差异,同时与常规新鲜MⅡ卵ICSI后相应指标进行比较。结果人卵母细胞玻璃化冷冻能取得较好的存活率,明显高于慢速冷冻;玻璃化冷冻后的存活卵母细胞ICSI受精率与常规ICSI无明显差异,但卵裂率、优质胚胎率明显低于常规ICSI。结论玻璃化冷冻人卵母细胞能取得较高的存活率;自制叶片和冷冻环都是较为理想的冷冻载体,二者用于玻璃化冷冻效果相近,自制叶片具有成本低、易操作的优点;体外自然成熟卵玻璃化冷冻后继续发育潜能降低,人卵母细胞的冻存还需要更多的研究。     

玻璃化冷冻技术临床应用的安全性

随着体外受精一胚胎移植（IVF—ET）及其衍生技术的不断发展,低温冷冻保存配子、胚胎以及卵巢或睾丸组织已经成为人类辅助生殖技术（ART）中一个重要的环节。近年来,玻璃化冷冻技术成功用于冻存人类卵母细胞和胚胎。然而,玻璃化冷冻要达到普及性应用之前仍有许多安全性问题有待解决,包括高浓冷冻保护剂毒性、开放式冷冻载体交叉污染、液氮病原微生物潜在污染以及复苏后胚胎发育潜能及损伤鉴定等。度     

组织玻璃化冻存技术：优势与尚未完全解决的问题

文题释义：玻璃化冷冻保存：是利用这些高浓度的低温保护剂组合成玻璃化冻存液,通过与水分子发生强烈的水合作用,增加溶液黏性,降低冰晶形成速度,从而使细胞在快速降温或复温过程中得以保护。 玻璃化：对于非晶高分子,当高分子通过降温从高弹态转变为玻璃态,或者通过升温从玻璃态转变为高弹态的过程称之为玻璃化转变,发生玻璃化转变的温度叫玻璃化转变温度。对于结晶高分子,玻璃化转变是指其非晶部分所发生的由高弹态向玻璃态(或者玻璃态向高弹态)的转变。因此,玻璃化转变是高分子中普遍存在的现象。但是玻璃化转变现象并不局限于高分子,一些小分子化合物也存在玻璃化转变。 背景：玻璃化冷冻保存是一种应用前途广阔的低温冷冻方法,通过使用高浓度的玻璃化冻存试剂将生物材料进行玻璃态转变,从而实现活性保存。 目的：就玻璃化冻存的生物学原理及玻璃化冻存试剂的分类,卵巢、皮肤与角膜等医学组织标本的玻璃化冻存进行综述。 方法：以“tissue;vitrification;cryopreservation”为英文检索词;“组织;玻璃化;冷冻保存”为中文检索词,检索1994年1月至2019年10月 PubMed 数据库及万方医学网相关文献。按照纳入与排除标准筛选后,对最终纳入的45篇文献进行归纳总结。 结果与结论：玻璃化冻存可以防止细胞内外冰晶形成,避免了冰晶给细胞带来的多种损伤,有效保留了细胞的生物活性与基本功能。玻璃化冻存试剂主要分为渗透性和非渗透性2种,其操作简便、高效,唯一的缺点是高浓度的冻存试剂对细胞具有一定的毒性损伤。为了降低对组织整体损伤风险,可以混合使用多种低毒冻存试剂。目前玻璃化冻存技术已经成功应用于多种细胞,但组织冻存的技术难题尚未完全解决。 ORCID: 0000-0003-0140-9935(张源) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

改善卵母细胞冷冻损伤的研究进展

卵母细胞的冷冻保存是女性生育力保存最具前景的技术。但由于卵母细胞特殊的生理结构,极易在冷冻过程中受到损伤。因此改进冷冻方法,添加冷冻保护剂(包括细胞骨架稳定剂和抗氧化剂)可以改善冷冻损伤,增加发育潜能,同时对于冷冻技术的运用有着重要意义。     

卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展

背景：卵巢组织玻璃化冷冻技术作为一种快速、简便、经济的冷冻方式被逐渐应用于卵巢组织的保存。 目的：综述国内外关于卵巢组织玻璃化冷冻保存及移植的研究进展。 方法：由第一作者检索1995/2011 PubMed数据库及清华同方数据库有关卵巢组织玻璃化冷冻保存以及卵巢组织移植技术等方面的文献。 结果与结论：玻璃化冷冻是一个超高速的冷冻过程,形成高黏度的“玻璃样凝固状态”,可以避免由于冰晶形成所造成的细胞损伤。但至今玻璃化冷冻仍缺乏统一的标准化程序。影响卵巢组织玻璃化冷冻保存效果的主要因素有卵巢组织块的大小、冷冻保护剂的种类、渗透平衡的时间和温度、冷冻载体等。随着低温生物学的发展和卵巢组织冷冻保存效果的提高,卵巢组织的移植已经具备了一定的临床应用可行性。到目前为止,全世界已有一系列关于冻存卵巢组织移植后成功妊娠及分娩的报道,移植成功的关键在于减少缺血再灌注损伤和促进新生血管的形成。关键词：卵巢组织;玻璃化冷冻;移植;保存;综述 缩略语注释：SSV：solid-surface vitrification,固体表面;NIV：needle immersed vitrification,针浸润玻璃化冷冻法;DCV：direct cover vitrification,直接覆盖玻璃化方法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.18.039     

玻璃化冷冻在保存女性生育能力中的应用

随着体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术的不断发展,低温冷冻保存已经成为人类辅助生殖技术（ART）中必不可少的一个环节。目前,人们可以通过低温冷冻卵母细胞、胚胎或卵巢组织来保存女性的生育能力。常用的冷冻方法有慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。近年来,玻璃化冷冻已经成为ART领域中引人注目的焦点之一。本文综述了玻璃化冷冻在保存女性卵母细胞、胚胎和卵巢组织中的研究进展。     

微滴法及麦管法玻璃化冻存家兔卵巢组织的比较研究

目的观察微滴法及麦管法玻璃化冻存家兔卵巢组织对各级卵泡的形态学及卵母细胞增殖活性的影响,探讨适宜的卵巢组织玻璃化冻存方案及玻璃化冷冻容皿。方法将6只健康雌性日本大耳白家兔随机分为2组,分别采用无载体的微滴法及麦管法以DMSO+EG方案玻璃化冻存家兔卵巢组织,复苏后行HE组织切片染色及PCNA免疫组化染色,显微镜下观察各级卵泡组织形态学的改变及始基卵泡和初级卵泡卵母细胞PCNA表达的变化。结果1.微滴法及麦管法玻璃化冻存家兔卵巢组织复苏后始基卵泡、初级卵泡及次级卵泡的形态正常率分别下降为75.00%和78.80%、47.07%和41.18%及14.29%和29.49%,与新鲜对照组比较(86.92%、78.57%及86.67%),差异均有显著性(P0.05);而两组间比较,差异无显著性P0.05)。2.微滴法及麦管法玻璃化冻存家兔卵巢组织,始基卵泡及初级卵泡母细胞PCNA阳性表达率分别为73.77%及70.87%,与新鲜对照组比较(78.04%),差异无显著性(P0.05);两组间比较,差异也无显著性(P0.05)。结论1.微滴法及麦管法玻璃化冷冻方案均对家兔卵巢组织造成一定程度的损伤,各级卵泡的形态正常率明显下降。但始基卵泡仍能保持较高的形态正常率(75.00%和78.80%)。2.上述两种冷冻方法对家兔卵巢组织始基及初级卵泡卵母细胞的增殖活性未造成明显影响,PCNA的阳性表达率无明显变化。3.微滴法玻璃化冻存家兔卵巢组织对各级卵泡形态学的影响及对始基、初级卵泡卵母细胞PCNA的表达与麦管法比较无明显差异。4.麦管法因避免了组织与液氮的直接接触,故可避免微生物的污染,临床应用更安全可靠,所以目前玻璃化冷冻卵巢组织应以麦管法为宜。     

卵母细胞玻璃化冷冻技术在体外受精-胚胎移植中的应用

目的探讨卵母细胞玻璃化冷冻技术在体外受精-胚胎移植中的应用价值。方法选取取卵日取精失败进行卵母细胞冷冻的174枚卵母细胞,按冷冻方法分为两组,A组共101枚卵母细胞,行慢速程序化冷冻;B组共73枚卵母细胞行玻璃化冷冻。比较两组卵母细胞的复苏率、受精率、2PN受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率、临床妊娠率。结果 B组(玻璃化冷冻组)的复苏率、受精率、2PN率、可利用胚胎率、优质胚胎率,均显著高于A组(慢速冷冻组),两组患者平均年龄、平均移植胚胎数、妊娠率均无显著性差异。结论与慢速冷冻相比,卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻效率更高,卵母细胞玻璃化冷冻是体外受精治疗中取精失败后保存女性生育力最佳的补救措施,避免了女性生殖细胞的浪费。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响

目的 探讨玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响.方法以小鼠MⅡ期卵母细胞为模型,将未经冷冻直接进行培养的卵母细胞设为对照组,将经玻璃化冻融后再进行培养的卵母细胞设为试验组,观察是否出现单原核或卵裂及囊胚形成情况.结果未经玻璃化冻融处理的卵母细胞有2.96%发生孤雌发育,而经玻璃化冻融处理的卵母细胞孤雌发育率达13.50%,两者存在明显差异.(P<0.05),但均未见囊胚形成.结论玻璃化冷冻可诱发卵母细胞发生孤雌发育,但这些孤雌发育的胚胎难以发育到囊胚阶段.     

人类卵母细胞冷冻技术对其超微结构影响的研究进展

卵母细胞冷冻技术一直是生殖医学领域研究的热点和难点之一.由于结构的特殊性使得卵母细胞对低温敏感,同时由于冷冻保护剂的毒性和冷冻方法不同易导致卵母细胞的结构损害.本文就目前冷冻技术对人类卵母细胞超微结构的影响做一综述.     

纳米颗粒对猪GV 期卵母细胞低温保存效果的影响

纳米低温保存技术很可能是新一代低温保存技术的重要发展方向,但纳米颗粒应用于卵母细胞玻璃化保存的报道较少。本研究将羟基磷灰石（HA）、二氧化硅、三氧化二铝、二氧化钛等4种纳米颗粒添加到低温保护剂中,使用Cryotop法冷冻猪GV期卵母细胞,使用形态观察和荧光染色的方法, 研究其对细胞存活率和发育率的影响。结果显示在实验浓度范围内,HA较其它纳米颗粒对猪卵母细胞的毒性低,当浓度低于0.5%时,细胞发育率为100%;低温保护剂中添加0.1%HA纳米颗粒,发育率比其它组显著提高,可以达到22%, 且HA的粒径对结果影响不大;当低温保护剂中添加0.05%粒径为60 nm的HA颗粒时,卵母细胞冷冻复温后发育率会进一步从14.7%提高达到30.4%。在低温保护剂中添加适宜浓度的HA纳米颗粒,可以减少复温过程中的重结晶现象,促进细胞的冷冻存活率和发育率,保存效果与浓度相关,而与纳米颗粒的粒径关系不大。     

玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对人卵裂期胚胎冷冻复苏效果及临床结局的比较

目的比较辅助生殖技术中玻璃化和程序化2种冷冻方法对卵裂期胚胎的冷冻复苏效果及临床结局。方法对3396个玻璃化冷冻周期和685个程序化冷冻周期的相关资料进行回顾性统计学分析,比较解冻后胚胎复苏率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎着床率等指标。结果玻璃化冷冻后的胚胎复苏率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎着床率均显著高于程序化冷冻,且复苏周期移植取消率显著低于程序化冷冻。结论相对于程序化冷冻法,玻璃化冷冻法具有更好的冷冻复苏效果以及临床结局,更适用于卵裂期胚胎的冷冻保存。     

卵母细胞深低温保存的策略分析

背景：卵母细胞具有特殊而复杂的低温生物学性质,致使卵母细胞在深低温保存中易受到多因素的损伤而影响复温后的存活率、受精率和受精后发育潜能。 目的：综述卵母细胞深低温保存技术的研究进展,阐明存在的技术缺陷以及解决问题的思路与研究路线。 方法：以“卵母细胞,深低温保存/慢速冷冻,玻璃化”为中文捡索词,以“oocyte, cryopreservation/slow freezing, vitrification”为英文检索词,在中国知网(CNKI)期刊全文数据库和PubMed数据库检索2004 年1月至2014年10月有关卵母细胞深低温保存文献,排除陈旧性、重复性研究,最终纳入41篇文献进行综述。 结果与结论：慢速冷冻、玻璃化方法深低温保存卵母细胞得到较好的临床应用,但复温存活率、受精能力、发育能力损伤等仍困扰医生们。卵母细胞深低温保存技术的进一步完善或突破在于对深低温保存技术环节的细化、卵母细胞低温生物学特性的研究以及相关技术的创新,如深低温保护剂选择、冷冻载体的改进、卵母细胞时相选择、卵母细胞体外成熟技术、卵巢组织保存与移植等。     

圆头精子的冷冻保存

目的:探讨圆头精子的冷冻保存效果及其精子功能改变。方法:6例圆头精子症患者各提供1-3份精液标本,应用不含卵黄冷冻保护剂和二步降温方法冷冻保存圆头精子症标本,检测冷冻精子活动率、头-尾膜完整率、存活时间和顶体蛋白酶活性。结果:圆头精子标本冷冻保存后,精子活动率显著减少,膜完整率显著下降,头膜损伤-尾膜完整的精子率显著升高(n=13,P＜0.01)。体外存活时间缩短。精子冷冻前后无顶体蛋白酶活性。不含卵黄冷冻保护剂与含卵黄冷冻保护剂,以及两步冷冻与多步冷冻的效果比较未见显著差异(n=7,P＞0.05)。结论:圆头精子可经历冷冻保存后存活,但冷冻复苏率低。冷冻-解冻过程显著降低精子功能。不含卵黄冷冻保护剂和两步降温可应用于冷冻保存圆头精子症标本。     

玻璃化溶液EG5.5对小鼠未成熟卵发育能力的影响

目的研究玻璃化溶液EG5.5对未成熟卵母细胞成熟、受精和发育能力的影响.方法小鼠成熟卵母细胞经玻璃化溶液EG5.5暴露处理但不予以冷冻保存,然后行体外成熟、体外受精和胚胎培养;新鲜的未成熟卵直接行体外成熟和受精作为对照组,比较两组卵母细胞的成熟率、受精、卵裂率和囊胚形成率.结果EG5.5暴露组卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率与对照组均无显著差异.结论EG5.5不影响未成熟卵的成熟、受精和进一步发育能力.     

微流体装置线性去除猪MII期卵母细胞冷冻保护剂的实验研究

低温保存后的卵母细胞在使用前必须要去除冷冻保护剂,目前常用的分步法去除步骤繁琐,容易丢失细胞,而且会对细胞造成致命的渗透损伤。为减小细胞渗透损伤,设计制作适合卵母细胞保护剂去除的微流体装置,研究微流控线性法去除猪MII期卵母细胞低温保护剂时在不同时间(6、8、10 min)下卵母细胞的体积变化,以及对卵母细胞存活率与发育率的影响;并与传统的去除方法(一步法和分步法)进行比较。结果表明,采用微流体装置线性去除冷冻保护剂,8 min为实验中的最优去除时间;线性法能够明显减小细胞的渗透损伤,其最大归一化渗透膨胀体积为1.12±0.07,卵母细胞的存活率、卵裂率及囊胚率分别达到83.6%、72.4%、21.5%,均显著高于一步法和分步法(P<0.05)。因此,微流控线性去除冷冻保护剂能够显著减小细胞的渗透损伤,为卵母细胞低温保存技术提供新思路。     

玻璃化保存肌腱的生物力学观察

目的探讨玻璃化保存法对兔肌腱力学性能的影响。方法玻璃化保存组，6条新鲜胫前肌肌腱，以18．64％二甲基亚砜＋13.37％乙酰胺＋9．17％1．2丙二醇＋浓度0．10mmol／L海藻糖＋10％小牛血清为玻璃化冷冻保护剂．将新西兰纯种大白兔肌腱采用三步法预处理．-196℃液氮保存14d；“两步法”深低温冷冻保存组，6条新鲜胫前肌肌腱，以15％二甲基亚砜＋10％小牛血清作为冷冻保护剂，“两步法”处理后-196℃液氮冷冻保存14d；对照组．6条新鲜新西兰纯种大白兔胫前肌肌腱。分别进行肌腱拉伸实验．检测肌腱破坏载荷峰值、最大载荷拉伸位移及杨氏弹性模量。结果肌腱破坏荷载峰值：新鲜肌腱组与玻璃化保存组及“两步法”深低温冷冻保存组间差异均有统计学意义（P=0．002），玻璃化保存组与“两步法”深低温冷冻保存组无统计学意义（P=0．256）；最大载荷拉伸位移：新鲜肌腱组与玻璃化保存组及“两步法”深低温冷冻保存组3组间均无统计学意义（P=0．065）；杨氏弹性模量：新鲜肌腱组与玻璃化保存组及“两步法”深低温冷冻保存组间差异均有统计学意义（P=0．006）．玻璃化保存组与“两步法”深低温冷冻保存组差异无统计学意义（P=0．577）。结论玻璃化保存法保存肌腱具有良好的发展前景。