人血清层粘连蛋白直接化学发光免疫分析法的建立及评价

目的建立检测人血清层粘连蛋白(LN)的直接化学发光免疫分析法(CLIA),并对检测性能进行方法学评价。方法采用包被有抗人LN单抗的微米级磁珠和吖啶酯标记抗人LN单抗分别作为固相试剂和发光试剂,建立并优化定量检测人血清LN水平的CLIA法,评价该方法的线性范围、灵敏度、精密度和特异性等性能指标,并与市场上同方法学的LN检测试剂盒进行相关性比对分析。结果该方法线性范围为5.00~1 000.00ng/mL,检测灵敏度小于5.00ng/mL,血清平均回收率为97.60%,批内变异系数(CV)小于5.00%,批间CV小于8.00%,特异性、稳定性良好,与市场上同方法学的LN检测试剂盒具有较好相关性。结论建立的人血清LN直接化学发光免疫分析法能够满足临床检测需求。     

磁性微球时间分辨免疫技术定量检测糖类抗原199的研究

目的建立检测糖类抗原(CA)199的磁珠时间分辨荧光免疫分析法(Nano-TRFIA)。方法采用磁珠耦联标记抗CA199单克隆抗体(B1),Eu~(3+)标记抗CA199单克隆抗体(Eu~(3+)-CA199-B7),采用双抗体夹心法建立基于磁性微球法的CA199检测方法 Nano-TRFIA,并对90份血清标本进行该方法血清学检测。结果 Nano-TRFIA检测CA199的灵敏度为0.2U/mL,甲胎蛋白、CA125对CA199-TRFIA均无交叉反应。磁珠耦联B1 4℃保存3个月免疫反应基本无损;同批试剂连续3个月应用分析结果稳定,样品的平均添加回收率为97.91%,批内和批间变异系数(CV)分别为4.84%和8.32%。Nano-TRFIA检测血清CA199结果与电化学发光法(ECLIA)检测结果显著相关(Y=0.969 8 X+4.015 3)。以ECLIA为金标准,Nano-TRFIA检测血清CA199时2份标本出现了假阳性。结论 Nano-TRFIA的灵敏度、特异度、准确度等均符合临床应用要求,为进一步临床验证奠定了基础。     

磁微粒-吖啶酯化学发光游离甲状腺素检测试剂的研制及应用

目的研制定量检测游离甲状腺素的化学发光免疫试剂。方法制备吖啶酯-T4结合物作为信号标记物质,制备链霉亲和素-磁性微球作为固相载体,结合生物素标记的甲状腺素(T4)抗体,建立小分子竞争法免疫分析体系,分析其灵敏度、准确度和线性范围等性能指标。结果灵敏度为1.5pmol/L,线性范围2~75pmol/L,批内不精密度CV为5.62%~8.24%,批间不精密度CV为7.08%~9.82%,与T3和rT3无交叉反应,37℃6d后发光值降幅为10.7%~14.6%,检测100例临床血清标本,测定结果与进口试剂的相关性r值等于0.924 5。结论该试剂具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好、受环境影响小、检测结果准确等特点,可配套全自动化学发光免疫分析系统,应用于临床检测。     

基于磁颗粒化学发光免疫分析方法检测鳞状细胞癌抗原?

目的：建立一种快速、灵敏的化学发光免疫分析方法检测人血清中鳞状细胞癌抗原(SCCA)水平。方法使用异鲁米诺(ABEI)和异硫氰酸荧光素(FITC)分别标记 SCCA 的单克隆抗体,与待测 SCCA 抗原通过夹心法免疫反应形成抗原抗体复合物,采用包被有 FITC 的磁颗粒作为固相分离载体,加入底物之后检测发光强度。结果本方法线性范围达到22 ng/mL,灵敏度为0.025 ng/mL,批内变异系数(CV)和批间 CV 分别小于6%和7%。与现有的 SCCA 检测方法进行比对,相关系数为0.9901。结论基于磁颗粒化学发光免疫分析检测 SCCA 的方法性能稳定、可靠,可用于定量检测人血清中 SCCA 浓度。     

白细胞介素-6量子点荧光免疫层析法的建立及性能验证

目的 研发出快速检测白细胞介素(IL)-6的量子点荧光免疫层析法试剂盒.方法 通过量子点荧光材料标记IL-6抗体,研发出一种能快速定量检测IL-6浓度的量子点免疫荧光层析法试剂盒,验证其灵敏度、回收试验、精密度、特异度、稳定性及其与贝克曼化学发光IL-6检测试剂盒的相关性.结果 试剂盒线性范围为10～4000 pg/mL,试剂盒决定系数R2≥0.950;最低检出限为2 pg/mL;在低、中、高浓度范围内的回收率均值分别为95.68％、101.23％、104.45％;批内精密度的变异系数(CV)为2.21％～3.93％,批间精密度的CV为2.42％～5.36％;特异度试验中交叉反应率均小于0.1％.结论 该研究自制的试剂盒灵敏度、准确性、精密度、特异度及稳定性都较好,能够准确、快速地完成临床样品IL-6浓度的定量检测.     

化学发光磁微粒免疫分析法定量检测HBsAg

摘要：目的：建立定量检测HBsAg的化学发光磁微粒免疫分析法。 方法：2株抗HBs单克隆抗体分别标记吖啶衍生物和生物素化,生物素化的抗HBs通过链霉亲合素包被到磁珠上形成致敏磁珠。将待测标本加入吖啶标记的抗HBs（吖啶-抗HBs）与致敏磁珠的体系中,形成致敏磁珠-HBsAg-吖啶标记抗HBs夹心复合物,磁性分离清洗。重复加样1次,磁性捕获分离后激发吖啶衍生物发光,用化学发光分析仪检测光强度,计算标本中HBsAg的浓度。 结果：该法线性方程为Y=0.919X+4.28,相关系数r²为0.99,线性范围为0.019 7~250.00 IU/mL。灵敏度可达0.020 7 IU/mL。0.1、3.2和40 IU/mL样本各重复测定10次的变异系数（CV）值分别为2.70%、4.40%和2.70%。与Abbott公司HBsAg定量检测试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法) 检测40份标本浓度的线性相关方程为Y=0.980 8X+0.209 9,r²=0.99,两法结果差异无统计学意义（t=1.519,P＞0.05）。以10、50、100和200 IU/mL作为检定点,各检定点相对偏差分别为0.18%、1.50%、1.71 %和1.81%。 结论: 建立的方法有较高的灵敏度、合适的线性,同时具备良好的可重复性,与Abbott公司试剂盒检测结果高度相关。     

PCT荧光免疫层析检测方法的建立及性能评价

目的建立一种荧光定量降钙素原(PCT)检测方法。方法利用双抗体夹心法原理,建立PCT免疫检测方法,并对本方法进行了精密度、灵敏度、线性、相关性等性能指标的测定。结果本检测方法的灵敏度为0.04ng/mL,精密度CV10%,线性范围为0.04~51.14ng/mL,与罗氏Cobas E601PCT相关系数r为0.996。结论本研究建立了PCT荧光免疫检测方法,各项性能指标均达到临床检测要求,可用于临床血清PCT浓度的检测。     

化学发光酶免疫分析法定量检测人血清层粘连蛋白

摘要：目的：建立检测人血清层粘连蛋白（LN）的化学发光酶免疫分析法(CEIA)。 方法：用3 μg/mL抗人LN单抗包被微孔板制成固相抗体,辣根过氧化物酶标记抗人LN单抗浓度为1∶2 000,建立检测人血清LN浓度的CEIA法。评价该法的线性范围、灵敏度、稳定性等性能指标;并与ELISA法检测LN进行比对;初步检测100例健康献血员血清LN水平。 结果：该法线性范围为22~1 635 ng/mL,灵敏度为12.2 ng/mL,批内、批间变异系数均＜10%,检测高、中、低值LN血清的回收率分别为00.9%、95.2%和105.0%;试剂在4 ℃和37 ℃条件下至少稳定7 d;健全性良好;与ELISA法检测LN结果差异无统计学意义（t=0.299,P>0.05）;100例健康献血员LN水平为（44.9±16.3） ng/mL。 结论：成功建立定量检测LN的CEIA法,该法性能较好,可用于临床检测。     

基于抗体-适配子建立的高尔基体蛋白73检测方法的研究

目的建立基于抗体-适配子双夹心的高尔基体蛋白73(GP73)ELISA检测方法,并用于血清GP73的检测。方法以抗体-适配子双夹心的模式,通过正交试验和方阵滴定试验确定GP73特异性抗体和适配子最佳工作水平、反应的温度和时间等。以GP73重组蛋白建立标准曲线并评价该方法灵敏度、精确度、线性及准确度等。利用该方法对59例对照组患者及77例肝癌患者血清进行GP73水平检测,并同步进行电化学发光定量测定甲胎蛋白(AFP)水平。结果该方法标准曲线的批内变异系数(CV)为3.87%,批间CV平均为4.44%;平均回收率为95.8%,灵敏度达12.0ng/mL。肝癌患者血清GP73水平均明显高于对照组、肝炎组和肝硬化组(P0.05)。GP73对原发性肝癌诊断灵敏度为85.7%,而AFP为62.3%;而早期肝癌中GP73和AFP灵敏度分别为76.7%、36.7%。结论成功建立基于抗体-适配子夹心的GP73ELISA检测方法,该方法可用于临床检测GP73水平。     

甲状腺过氧化物酶抗体间接时间分辨荧光免疫分析法的建立及临床应用

目的建立甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体间接时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）。方法用TPO抗原包板,用铕（Eu^3＋）标记兔抗人IgG做标记物,建立检测人血清TPO抗体的间接TRFIA。结果TPO抗体-TRFIA的敏感性为1.0 IU/mL;线性范围达1 000 IU/mL;批内变异系数（CV）为3.1%-3.6%,批间CV为3.3%-3.6%;平均回收率为98.89%;与电化学发光分析法（ECLIA）比对,相关系数达0.983 2;与临床诊断高度相关。结论本研究建立的TPO抗体-TRFIA是一个高灵敏和可靠的检测方法,有助于甲状腺疾病的临床诊断。     

Performance evaluation of a chemiluminescence microparticle immunoassay for CK‐MB

Background

To verify and evaluate the performance characteristics of a creatine kinase phosphokinase isoenzymes MB (CK‐MB) assay kit, which produced by Xiamen Innodx Biotech Co. Ltd.

Methods

Evaluation was carried out according to “Guidelines for principle of analysis performance evaluation of in vitro diagnostic reagent.” The performance parameters included detection limit, linearity range, reportable range, recovery test, precision verification, interference test, cross‐reactivity, matrix effect, and method comparison.

Results

The detection limit was 0.1 ng/mL. The assay had clinical linearity over range of 0.1 ng/mL‐500 ng/mL. Reportable range was from 0.1 ng/mL to 1000 ng/mL. The average percent of recovery was 99.66%. The coefficient of variation (CV) for within‐run and between‐run of low CK‐MB sample was 5.55% and 6.16%, respectively. As for high‐level sample, it was 7.88% and 7.80%. In medical decision level, the relative deviation (Bias) of all interference tests was lower than 15%. When the sample had mild‐hemolysis; hemoglobin ≤15 g/L; triglyceride ≤17 mmol/L; bilirubin ≤427.5 μmol/L; rheumatoid factor ≤206U/mL, there was no significant interference to be found. Moreover, assay kit had no cross‐reaction with CK‐MM and CK‐BB. At last, total diagnostic accuracy of kit was 93.24%, when compared with refer kit.

Conclusion

Overall the results of the verification study indicated the performance of kit is met the requirements of the clinical test.

     

羧基磁珠吸附乙型肝炎病毒表面抗原的性能研究

目的研究羧基磁殊吸附乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的性能，为磁珠在蛋白质分离纯化中的应用打下基础。方法检测羧基磁珠吸附HBsAg前后的蛋白量，判断磁珠用量、HBsAg浓度、吸附温度、吸附时间对磁珠吸附HBsAg的影响。使用10mmol／LNaOH洗脱HBsAg，测定洗脱后HBsAg的洗脱率和生物活性保留率。结果羧基磁珠吸附HBsAg的性能与磁珠用量、HBsAg浓度、吸附温度和吸附时间有密切关系。磁珠吸附浓度为524．24ug／mL的血源性HBsAg纯品后，10mmol／I。NaOH溶液洗脱HBsAg的洗脱率是71．02％，活性保留率为88．15％。结论带有羧基的磁珠可以吸附HBsAg，有望用于HBsAg的分离回收，为磁珠在蛋白质分离纯化中的应用打下基础。     

血浆蚓激酶定量检测方法的建立及评价

本研究目的建立血浆蚓激酶的定量检测方法,并利用该方法分析人血浆样本中的蚓激酶含量。利用蚓激酶免疫家兔和BALB/c小鼠,制备其兔源及鼠源的多克隆抗体,建立双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定蚓激酶的方法,绘制蚓激酶含量检测标准曲线,进一步对该方法的特异性、精密度、回收率等进行了分析。利用建立的双抗夹心ELISA检测方法对人血浆中的蚓激酶进行检测,并对检测结果进行评价。结果表明,本研究建立的双抗夹心ELISA检测蚓激酶的标准曲线拟合R值>0.99;精密度评价3个批次内及批间测定值的变异系数(CV)均<15%;回收率评价3个批次内及批间测定值回收率均>80%;定量下限为5 ng/ml(精密度CV<15%,回收率>85%)。结论:本研究建立的双抗夹心ELISA检测方法符合药典所规定的标准,满足药代动力学评价的基本要求,可为蚓激酶的临床试验研究提供可靠的检测方法。     

化学发光技术中磁珠浓度对光信号水平的影响

目的观察化学发光技术中链霉亲和素磁珠浓度对发光信号的影响。方法 (1)在全自动化学发光分析仪中夹心法模式和竞争法模式分别使用其混合试剂和高值/低值混合血清,夹心法采用β-HCG测量程序,竞争法模式采用Prog测量程序,观察在不同浓度磁珠中的光信号变化;(2)在分光光度计上620nm波长测量不同浓度磁珠的吸光度和透光率;(3)在全自动化学发光分析仪中测量一定量的发光物质在不同浓度磁珠中的光信号强度;与磁珠浓度0mg/mL相比,差异超过10%认为会导致较大差异。结果 (1)随着磁珠浓度的增加,光信号呈现为上升期、平台期和下降期。(2)磁珠浓度越大,吸光度越大,透光率越小。(3)当磁珠浓度在夹心法模式中<0.36mg/mL、竞争法模式中<0.72mg/mL时,光信号减少程度在10%以内。当磁珠浓度在夹心法模式中>0.36mg/mL、在竞争法模式中>0.72mg/mL时,磁珠浓度越大,光信号越弱,磁珠浓度与光信号水平呈负相关(夹心法R2=0.837 7,竞争法R2=0.894 3)。结论应用磁珠的化学发光技术中,磁珠浓度增大或减少过多均可导致光信号减弱,使夹心法项目检测结果假性降低而竞争法项目检测结果假性升高。     

应用荧光法筛查葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症

目的探讨荧光法筛查新生儿葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症中的实用性。方法新生儿出生72 h后采足跟血,滴在规定的滤纸上,采用荧光法测定G6PD活性水平,同时与荧光斑点法、G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脱氢酸(6PGD)比值法进行比较。并且检测3 706例新生儿G6PD正常水平及筛查临界值(cut off值)。结果该方法最低检测限为0.52 U/gHb,批内平均变异系数(CV)为9.8%,批间平均CV为11.1%,高、中、低3个浓度的平均回收率为96.4%。实验结果与目前国内筛查使用的荧光斑点法的符合率为97.5%,和G6PD/6PGD比值法的符合率为100%。筛查cut off值建议定为2.7 U/gHb。结论荧光法适用于新生儿G6PD缺乏症的筛查。     

免疫比浊法检测血清游离轻链的方法学评价

目的对Beckman Immage 800全自动特种蛋白分析仪检测血清游离κ、λ轻链(sFLC)进行方法学评价。方法通过Beckman Immage 800定量测定sFLC,探讨其精密度、正确度、分析测量范围、干扰和携带污染率,同时对其参考区间进行验证。结果κFLC低、高值批内精密度的变异系数(CV)分别为7.84%、2.95%,批间精密度的CV分别为7.38%、5.57%;λFLC低、高值批内精密度(CV)分别为4.59%、3.94%,批间精密度CV分别为3.97%、2.01%;测定κFLC、λFLC定值质控血清与靶值的偏倚小于5%;κFLC、λFLC分析测量范围分别为10.8~128.0 mg/L、10.1~121.0 mg/L时,a值在0.95~1.05,r2≥0.98;κFLC、λFLC携带污染率分别为0.411%、0.216%;干扰试验结果显示游离胆红素≤342.0μmol/L、结合胆红素≤342.0μmol/L、血红蛋白≤5g/L和乳糜≤2 400浊度时,对sFLC结果无明显影响;40例健康体检者中有1例κFLC测定结果超出厂家推荐的参考区间,40例λFLC检测值均在厂家推荐的参考区间内。结论 Beckman Immage 800全自动特种蛋白分析仪检测sFLC的主要分析性能符合质量目标的要求,能够为临床提供科学、准确的诊疗依据。     

双抗体夹心ELISA测定人广泛型线粒体肌酸激酶方法的建立

目的建立测定人血清广泛型线粒体肌酸激酶（uMtCK）浓度的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法应用原核表达的uMtCK重组蛋白免疫小鼠获得7株单克隆抗体,采用棋盘格滴定法筛选出最佳双抗体组合,其中抗体19F11进行辣根过氧化物酶（HRP）标记作为检测抗体,抗体3C1作为俘获抗体,建立检测人uMtCK双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价。同时采用该法检测50名健康体检者和85例肿瘤标志物[甲胎蛋白（AFP）或癌胚抗原（CEA）]阳性患者的血清。结果通过筛查获得配对抗体,建立检测人uMtCK的双抗体夹心ELISA方法。该法的检测限为28．8ng／mL,批内变异系数（CV）为4．5％～7．7％,批间CV为8．2％～13．5％,平均回收率为97．1％。用该法检测50名健康体检者血清uMtCK浓度,结果均为阴性;85例肿瘤标志物阳性患者中有15例检出uMtCK,浓度为52．8～1442．2ng／mL。结论建立的双抗体夹心ELISA可以用于测定人血清uMtCK浓度。     

磁性均相酶联免疫技术对内分泌激素的方法学评价及临床应用

目的探讨磁性均相酶联免疫技术及SEROZYME-Ⅲ型吸光值测定仪性能的可靠性。方法测促甲状腺激素（TSH）用磁性均相酶联免疫夹心法；测游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺激素（FT3）用磁性均相酶联免疫竞争法。结果最小检测量：FT3〈0．26pg／mL，FT4〈0．10pg／mL，TSH〈0．03 μIu／mL；回收率：FT3为95．93％，FT4为96．53％，TSH为96．36％；批间变异系数（CV）：FT3为4．2％，FT3为4．8％，TSH为4．5％；批内变异系数（XC%）：FT3为3．4％，FT4为3．2％，TSH为2．9％。用放射免疫法、免疫放射法与本法同时测定30份标本中的TSH、FT3、FT4含量，两种方法结果符合率FT3达0．927、FT4达0．935、TSH达0．936，均呈显著相关性。结论磁性均相酶联免疫技术及SEROZYME一Ⅲ型吸光值测定仪的灵敏度、精密度、准确度、特异性均达到标准要求，适宜中、小型医院临床推广应用。     

Receptor antibody time-resolved A2 phospholipase bead immunochromatography and its application in idiopathic membranous nephropathy

ObjectiveTo detect phospholipase A2 receptor (PLA2R) antibody by established time‐resolved fluorescent bead immunochromatographic assay.MethodsThe reaction time of coupling, pH of the reaction, and coupling ratio of the label to PLA2R were determined. The EDC method was used to covalently couple PLA2R to time‐resolved fluorescent beads, which were sprayed onto a bonding pad. PLA2R and rabbit anti‐PLA2R antibody sprayed onto a nitrocellulose membrane were used as detection and quality control lines, respectively. Immunochromatographic test strips were prepared to enable rapid detection of PLA2R antibodies. Various technical indicators were evaluated, and the correlation among this method, enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA), and serum analysis was examined.ResultsThe pH suitable for labeling was 6.5. The optimal mass ratio of PLA2R protein to fluorescent beads was 0.08:1, and the reaction time of coupling was at least 1.5 hours. The appropriate spray film size of the coupled fluorescent bead was 5 μL/cm, and the appropriate staining concentration of the test line was 0.28 mg/mL. Further, 80 µL of sample was required for the test, and the result was obtained in only 15 minutes. The measurable range of this method was 5‐1500 RU/mL. Intra‐ and inter‐assay coefficients of variation were 7.61% and 11.07%, respectively, with an average recovery rate of 93.77%. The method showed a good correlation with ELISA, with a correlation coefficient of 0.936.ConclusionsThis method could better meet the clinical demand for idiopathic membranous nephropathy (IMN) detection.     

RP-HPLC法测定人血浆中齐拉西酮质量浓度

目的建立用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定人血浆中齐拉西酮质量浓度的办法。方法以Acclaim~(TM)12 C_(18)反相柱(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,流动相为0.2%三乙胺-甲醇(15∶85);流速:1.1mL/min;柱温:35℃;检测波长:230nm,以乙酸乙酯为萃取剂。结果齐拉西酮在8.0~300.0ng/mL质量浓度范围内,其质量浓度与峰面积呈良好线性关系;齐拉西酮低、中、高质量浓度(8.0、80.0、350.0ng/mL)相对回收率均大于95%;提取回收率均大于90%。日内、日间相对标准偏差均低于10%(n=5)。分析方法的检测限为5.0ng/mL;齐拉西酮的曲线方程:Y=1.193 X+0.013,r=0.999 7(n=7)。结论该法灵敏、简单、准确、快速,可用于临床齐拉西酮血药浓度的监测。