负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探讨体外经小鼠肝癌细胞不同抗原致敏的CD40配体活化的B淋巴细胞诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤免疫的能力.方法:分离、纯化T、B混合淋巴细胞,并在CD40L、rmIL-4联合作用下培养.然后分离T、B淋巴细胞以备用.将凋亡的肝癌细胞及其冻融裂解物作为实验组,1640培养基作为空白对照组分别与B淋巴细胞共同培养,检测培养后各组B细胞表面抗原呈递细胞标记(CD40、CD80、CD86)及主要组织相容性抗原的表达情况.利用混合淋巴细胞增殖实验检测T细胞增殖情况.以负载肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导的CTL作为效应细胞,肝癌细胞Hepal-6为靶细胞,LDH释放实验检测杀伤活性.结果:负载肿瘤抗原的B淋巴细胞具有刺激T细胞增殖的能力,实验组的B淋巴细胞,其组织相容性分子及其刺激分子表达明显高于空白对照组,其对靶细胞的杀伤率与空白对照组比较经统计学分析差异有显著性.结论:负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞作为抗原呈递细胞诱导的CTL可有效产生特异性抗肝癌免疫作用.     

宫颈癌患者外周血CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞与白细胞介素-17水平及其相关性研究

目的探讨外周血CD4~+CD25~+调节性T淋巴细胞(Tr细胞)和白细胞介素-17(IL-17)水平在宫颈癌患者中的变化及其相关性。方法选取2014年1月至2015年3月该院确诊宫颈癌患者60例(宫颈癌组)和查体的健康女性60例(健康对照组),采用流式细胞仪检测外周血Tr细胞数量及占CD4~+细胞百分比,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-17水平。结果宫颈癌组外周血Foxp3~+Tr、Tr、CD4~+T淋巴细胞百分比,Foxp3~+Tr/Tr、Tr/CD4~+T淋巴细胞比值及血清IL-17水平均较健康对照组明显升高,而IL-17/Tr比值明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。宫颈癌组患者外周血CD4~+CD25~+Tr细胞水平与血清IL-17水平呈正相关(r=0.768,P0.05)。结论宫颈癌患者存在细胞免疫功能紊乱,IL-17与Tr细胞比值失衡可能在宫颈癌发病机制中起一定的作用。     

恒定自然杀伤T细胞在过敏性哮喘中的调节机制

恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是T淋巴细胞中独特的亚群,也是经典的自然杀伤T(NKT)细胞,既表达T细胞的表面标志,又表达自然杀伤(NK)细胞的表面标志CD161(NK1.1)分子和NK细胞受体P1C。活化iNKT的经典抗原是糖脂类抗原α-半乳糖神经酰     

初诊多发性骨髓瘤患者外周血淋巴细胞亚群的检测及意义

目的:通过检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者外周血淋巴细胞亚群评价MM患者机体的免疫功能状态并分析其与患者预后的相关性。方法:采用流式细胞术检测32例初诊MM患者和24例健康献血者的外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg);分别采用溴甲酚绿法、透射免疫比浊法检测患者血清白蛋白(albumin,Alb)、β2-微球蛋白(β2 microglobulin,β2-MG)。结果:与健康献血者比较,MM患者外周血淋巴细胞中CD3~+、CD4~+T淋巴细胞比例无显著改变(P0.05),CD8~+T淋巴细胞、NK细胞比例升高(P0.05),CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值、CD19~+B淋巴细胞比例降低(P0.05),CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T淋巴细胞的比例明显升高(P0.01)。CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T淋巴细胞的比例与MM的疾病分期呈正相关,与MM患者血清中的β2-MG浓度亦呈正相关(P0.05)。结论:MM患者体内在淋巴细胞亚群的异常表达可能与其肿瘤负荷、病情进展及预后有关。CD4~+CD25~+Treg细胞的表达异常可能是MM免疫逃逸的一个重要机制。     

严重细菌感染患者外周血DNT淋巴细胞检测及其临床价值

目的探讨严重细菌感染患者外周血CD4~-CD8~-双阴性T淋巴细胞(DNT淋巴细胞)的表达水平及其在细菌感染中的作用。方法选取2014年1月至2017年3月该院血培养阳性且临床明确诊断为严重细菌感染的87例患者纳入研究组,其中40例血培养转阴时间≥7d者为A组,47例转阴时间7d者为B组;选取30例该院健康体检者作为健康对照组。采用流式细胞术对3组人群外周血免疫细胞:CD3~+T淋巴细胞比例、CD4~+T淋巴细胞比例、CD8~+T淋巴细胞比例、自然杀伤(NK)细胞比例、B淋巴细胞比例、DNT淋巴细胞比例,以及CD4~+/CD8~+进行检测与对比分析。结果 (1)A组和B组患者CD3~+T淋巴细胞比例、CD8~+T淋巴细胞比例显著低于健康对照组,CD4~+/CD8~+显著高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05);(2)A组患者的DNT淋巴细胞比例高于B组和健康对照组,差异有统计学意义(P0.05);(3)A组B淋巴细胞比例显著高于B组和健康对照组,差异有统计学意义(P0.05);(4)B组NK细胞比例高于A组和健康对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞水平变化均影响严重细菌感染患者病原体清除效率,其中DNT淋巴细胞可能参与了对CD4~+T淋巴细胞免疫应答的抑制过程,不利于机体对病原体的清除。检测外周血DNT淋巴细胞对患者治疗方案的调整有一定的参考价值。     

中医疗法对过敏性紫癜患者免疫功能的调节作用

目的探讨以疏风清热、活血化瘀立法治疗过敏性紫癜(HSP)前后,外周血白细胞总数、淋巴细胞数、淋巴细胞亚群、辅助性T细胞(Th)1/Th2及调节性T细胞的变化。方法使用血细胞分析仪检测36例住院患者血常规,统计其中的白细胞总数及淋巴细胞数。使用流式细胞仪检测36例住院患者外周血淋巴细胞亚群、Th1/Th2及调节性T细胞。结果 HSP患者治疗后(恢复期)与治疗前(急性期)相比较,白细胞数、淋巴细胞数、CD3~+、CD4~+、CD19~+降低(P0.05),CD8~+、CD16~+CD56~+、Th1/Th2、CD4~+CD25~+升高(P0.05);HSP患者治疗前与对照组相比较,白细胞数、淋巴细胞数、CD3~+、CD4~+、CD19~+明显升高(P0.05),CD8~+、CD16~+CD56~+、Th1/Th2、CD4~+CD25~+降低(P0.05);HSP患者治疗后与对照组相比较,白细胞数、淋巴细胞数、CD19~+升高(P0.05);CD16~+降低(P0.05);CD3~+、CD4~+、CD8~+、Th1/Th2、CD4~+CD25~+无差异(P0.05)。结论以疏风清热、活血化瘀立法治疗HSP,能明显干预患者的外周血白细胞总数、淋巴细胞数、淋巴细胞亚群、Th1/Th2及调节性T细胞,对患者的免疫功能的调节作用明确,临床效果显著,极大地提高了临床诊疗能力。     

AIDS患者与正常人CD8+CD25+、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞计数对照研究

目的方法研究AIDs患者与正常人CD8+CD25+、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞数量差异,进一步了解AIDs患者免疫功能状态。方法:将研究对象分为两组:AIDs患者组与正常对照组。分别对AIDs患者组40余份样本与正常对照组30份正常人全血样本进行CD8CD25、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞计数检测。结果与正常对照组相比,AIDs患者组CD8CD25、CD4+CD25+细胞计数显著增加,B淋巴细胞计数下降,NK细胞计数下降,P<0.05,差异具有统计学意义。NKT细胞计数下降,差异无统计学意义,P>0.05。结论 AIDs患者CD8+CD25+、CD4+CD25+细胞计数增加,B淋巴细胞与NK细胞计数下降,NKT细胞计数与正常人无显著差异。     

杀伤细胞受体KIRs的研究进展

自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞,NK细胞不同于T、B淋巴细胞,它不表达抗原特异性受体,其功能的发挥主要依赖于NK细胞能够表达多种能与MHC或非MHC配体结合的免疫球蛋白样受体(Killerim munoglobulin-like receptors,KIRs)KIRs为免疫球蛋白超家族成员,表达于NK细胞和某些T细胞亚群.KIRs包括抑制型和激活型受体,其通过识别表达于靶细胞上的人类白细胞抗原1(MHC-1)类分子,调节NK细胞的杀伤活性,在自身免疫性疾病、妊娠、移植、肿瘤免疫等生理病理过程中起重要的作用.     

DC、CIK联合培养对肿瘤细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨DC(dendritic cells)、CIK(cytokine-induced killer cells)联合培养对肺腺癌细胞A549的杀伤活性的影响,并与单独CIK对A549杀伤活性进行比较,为肿瘤生物治疗提供有效方法。方法分别培养DC、CIK细胞,经鉴定后进行联合培养,联合培养3天后,对A549细胞进行杀伤活性实验,检测DC联合CIK及单独CIK对A549的杀伤活性,同时用流式细胞检测DC、CIK联合培养细胞及单独CIK细胞中淋巴细胞亚群的表达。结果 DC联合CIK对A549的杀伤活性为88.38%,CIK对A549的杀伤活性为66.24%,两者对A549的杀伤活性比较有显著差异(P0.01);DC、CIK联合培养的淋巴细胞亚群中的CD3+、CD4+、NK、NKT、CD3+HLA-DR+、CD8+CD28+的数量均高于CIK细胞。结论 DC、CIK联合培养对肺癌细胞A549的杀伤活性明显高于单独CIK对A549的杀伤活性(P0.01);抗肿瘤淋巴细胞(CD3+、CD4+、NK、NKT、CD3+HLA-DR+、CD8+CD28+)数量也明显高于CIK细胞。     

大鼠心脏移植急性排斥反应与CD8~+CD28~+T淋巴细胞钙离子的相关性研究

目的探讨CD8~+CD28~+T淋巴细胞胞外~(45)Ca~(2~+)摄取率、胞内Ca~(2~+)浓度与大鼠心脏移植急性排斥反应(AR)的相关性。方法用流式细胞仪分选大鼠对照组(T0)、假手术组(T_1)、实验组(T_2)术后第1、3、5、7、9、11天外周血CD8~+CD28~+T淋巴细胞,测量胞外~(45)Ca~(2~+)摄取率、胞内Ca~(2~+)浓度,进而分析CD8~+CD28~+T淋巴细胞胞外~(45)Ca~(2~+)摄取率、胞内Ca~(2~+)浓度与大鼠心脏移植后AR的相关性。结果T2组CD8~+CD28~+T淋巴细胞胞外~(45)Ca~(2~+)摄取率、胞内Ca~(2~+)浓度较T_1、T_0组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与心脏移植后AR程度的Spearman相关系数分别为0.494(P0.01)、0.688(P0.01)。结论外周血CD8~+CD28~+T淋巴细胞胞外~(45)Ca~(2~+)摄取率、胞内Ca~(2~+)浓度与大鼠心脏移植AR密切相关,有助于早期监测心脏移植术后AR。     

人外周血NKT细胞体外扩增及其分泌细胞因子的研究

目的　建立人外周血自然杀伤T细胞 (NKT)体外扩增及检测NKT细胞所分泌的细胞因子的方法。方法　分别采用单加α 半乳糖神经酰胺 (α Galcer组 ) ,单加树突状细胞 (DC组 )以及同时加α Galcer、DC(α Galcer、DC组 )的方法从人外周血单个核细胞 (PBMC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα2 4+ /TCRVβ1 1 + NKT细胞。采用细胞内细胞因子流式细胞术检测手段测定NKT细胞中IL 4 ,IFN γ、TNF α阳性细胞比例。结果　PBMC中的α Galcer组 ,DC、α Galcer组和纯化T淋巴细胞中的DC、α Galcer组 ,NKT细胞扩增 1 9d后分别占淋巴细胞的 (2 5 .5± 7.2 ) %、(1 8.2± 8.2 ) %和 (2 4 .8± 5 .5 ) % ,NKT细胞分别扩增了 (1 5 .1± 9.1 )× 1 0 3 倍、(2 1 .8± 1 7.3)× 1 0 3 倍和 (2 3.0± 1 6 .7)× 1 0 3 倍 ,与其它各组差异有显著性意义 (P <0 .0 1 )。扩增过程TCRVβ1 1+ NKT细胞中分泌IL 4 ,IFN γ和TNF α的细胞比例均高于TCRVβ1 1 T淋巴细胞 (P <0 .0 5 )。结论　α Galcer具有体外大量扩增NKT细胞的能力 ,同时α Galcer的激活能力受CD1d分子的限制。由于PBMC中的单核系细胞也表达CD1d分子 ,因此直接从PBMC扩增NKT也能获得良好的效果     

自然杀伤T细胞在幽门螺旋杆菌阳性消化性溃疡患者中的水平与临床意义

目的探讨幽门螺旋杆菌(Hp)阳性消化性溃疡患者(PU)外周血自然杀伤T细胞(NKT)的表达与临床意义。方法选择83例Hp阳性PU患者(A组),以79例Hp阴性PU患者作为阳性对照(B组),以60例健康人作为阴性对照(C组);采用流式细胞术检测A、B及C三组外周血NKT及其胞内细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)及白介素4(IL-4)水平。将A组患者随机分为D及E组,两组均给予雷贝拉唑及甲硝唑治疗,D组在此基础上给予克拉霉素治疗,E组给予阿莫西林治疗,两周后进行NKT、IFN-γ及IL-4的水平比较,并将3种指标与治疗前Hp感染的程度进行相关性分析。结果 B与C组间的NKT及IFN-γ差异均无统计学意义,但A组NKT及IFN-γ水平低于B及C组,差异有统计学意义(P0.05)。A组IL-4低于B组,且B组低于C组,差异有统计学意义(P0.05)。治疗前D及E组间的NKT、IFN-γ及IL-4差异均无统计学意义(P0.05),治疗后D组3种指标均显著高于E组(P0.05)。Spearman分析显示NKT、IFN-γ及IL-4均与Hp感染程度呈负相关。结论 NKT、IFN-γ及IL-4水平下降导致杀伤力降低可能原因为Hp感染致PU的免疫机制破坏,且感染越重三者水平越低;克拉霉素在上调NKT、IFN-γ及IL-4的表达效果优于阿莫西林。     

分娩发动前后体内NK细胞、NKT细胞表型分析

目的研究分娩发动前后蜕膜及外周血中NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况,探讨其在产程发动中的作用。方法选取正常孕足月孕妇分为分娩发动经阴道分娩组（以下简称分娩组20例）和分娩未发动行选择性剖宫产术组（以下简称剖宫产组20例）,分离蜕膜及外周血中单个核细胞后采用流式细胞学技术分别检测CD56＋细胞、NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况。结果外周血单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋细胞构成下降、CD56＋NKG2D＋细胞构成增加,NK细胞、NKT细胞表面NKG2D表达上升。蜕膜单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋和CD56＋NKG2D＋细胞构成及NK细胞表面NKG2A和NKG2D表达均下降,NKT细胞表面NKG2A和NKG2D表达无显著差异。结论临产前体内NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体表达的变化可能在在产程的发动中起着重要作用。     

外周血自然杀伤T淋巴细胞和CD4＋自然杀伤T淋巴细胞对哮喘患儿发病的影响

目的：探讨外周血自然杀伤T淋巴细胞（NKT细胞）和CD4＋NKT细胞对哮喘患儿发病的影响。方法选取2008年1月至2012年12月住院治疗的哮喘病患儿150例（哮喘组）,另选160例体检健康的儿童作为健康对照组。收集研究对象外周静脉血标本,采用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞,应用免疫荧光标记和流式细胞术检测哮喘组和健康对照组儿童外周血NKT细胞和CD4＋NKT细胞的比例,并观察两类细胞与过敏指标总免疫球蛋白E（IgE）、嗜酸性细胞阳离子蛋白（ECP）的相关性。酶联免疫吸附试验检测外周血细胞因子白细胞介素（IL）‐4、IL‐10、干扰素‐γ（IFN‐γ）水平。比较两组间的差异。结果哮喘组患儿的NKT细胞和CD4＋NKT细胞比例均较健康对照组明显下降（P＜0．05）。NKT细胞、CD4＋NKT细胞的比例与总IgE、ECP均无明显相关性（P＞0．05）。外周血IL‐4水平较健康对照组明显升高（P＜0．05）,IL‐10水平明显下降（P＜0．05）,而IFN‐γ水平与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论NKT细胞和CD4＋NKT细胞数量降低下及所分泌细胞因子功能变化是导致哮喘发病的重要原因。     

In vivo identification of glycolipid antigen-specific T cells using fluorescent CD1d tetramers

The CD1 family of major histocompatibility complex (MHC)-like molecules specializes in presenting lipid and glycolipid antigens to alpha/beta T lymphocytes, but little is known about the size of the CD1-restricted T cell population or the frequency of T lymphocytes specific for a given glycolipid antigen. Here, we report the generation and use of mouse CD1d1-glycolipid tetramers to visualize CD1d-restricted T cells. In contrast with previous BIAcore-based estimates of very short half-lives for CD1d-glycolipid complexes, we found that the dissociation rate of several different CD1d-glycolipid complexes was very slow. Fluorescent tetramers of mouse CD1d1 complexed with alpha-galactosylceramide (alphaGalCer), the antigen recognized by mouse Valpha14-Jalpha281/Vbeta8 and human Valpha24-JalphaQ/Vbeta11 natural killer T (NKT) cell T cell receptors (TCRs), allowed us for the first time to accurately describe, based on TCR specificity, the entire population of NKT cells in vivo and to identify a previously unrecognized population of NK1.1-negative "NKT" cells, which expressed a different pattern of integrins. In contrast, natural killer (NK) cells failed to bind the tetramers either empty or loaded with alphaGalCer, suggesting the absence of a CD1d-specific, antigen-nonspecific NK receptor. Mouse CD1d1-alphaGalCer tetramers also stained human NKT cells, indicating that they will be useful for probing a range of mouse and human conditions such as insulin-dependent diabetes mellitus, tumor rejection, and infectious diseases where NKT cells play an important role.     

诱导扩增脐血单个核细胞为T/NK细胞的实验研究

目的　探索体外诱导脐血单个核细胞 (MNC)扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系。方法　脐血MNC在 6种培养体系中培养 4周 ,于各时间点用流式细胞仪测定细胞表面T/NK标志抗原的表达 ;测定有核细胞 (NC)数 ;并行细胞形态学鉴定及细胞毒功能实验。结果　脐血MNC在SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α +IL 2体系中培养 ,第 2 2天NC数达 (2 0～ 2 6 )× 10 6/ml;淋巴细胞占NC的比例和CD3 + T细胞占淋巴细胞的比例均达到 90 %以上 ,以CD8+ T细胞亚群为主 ,CD4+ T细胞亚群比例下降 ;CD56+ CD3 + NKT细胞和TCRγδ+ 细胞的比例分别由不足 2 %升高到 30 %～ 4 0 %和 10 %～ 15 %。CD3 -CD56+ NK细胞无扩增。培养后细胞在效靶比为 5 0∶1时对K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤率分别达75 %以上和 32 %～ 6 5 %。结论　本实验中体外诱导脐血MNC扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系为SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α+IL 2 ,最佳扩增时间是培养后第 2 2天。     

间充质干细胞对活化T淋巴细胞的免疫调节作用

本研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对活化T淋巴细胞的免疫调节作用及其在allo—HSCT相关GVHD防治中的作用。用终浓度为10μg/ml的PHA于不同时间作用T淋巴细胞，以^3H—TdR掺入法检测T细胞增殖功能；以不同数量的MSC分别与活化T淋巴细胞作用，根据MSC数量不同实验分为A组（对照组，不加MSC）、B组（MSC2×10^4）、C组（MSC4×10^4）、D组（MSC8×10^4），用^3H—TdR掺入法检测作用前后T细胞功能，FCM检测细胞免疫表型。结果显示，在终浓度为10μg／ml PHA作用下，T淋巴细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强，48小时达高峰。FCM检测MSC细胞表型表明：CD44、CD105、CD29、FIK1表达阳性，不表达CD33、CD34、CD45、HLA—DR。随着MSC数量增加，与共培养前相比，T细胞的SI值逐渐降低（P〈0．05），但C组和D组间比较无差异（P〉0．05）。在低数量MSC作用下，CD3^＋CD4^＋表达低于对照组（P〈0．05），CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋高于对照组（P〈0．05）；C组和D组与对照组相比，CD3^＋CD4^＋表达明显降低（P〈0．01），CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋明显增高（P〈0．01）。结论：丝裂原PHA可以使T细胞活化；骨髓MSC在体外可以使活化T细胞功能和细胞免疫表型发生改变，下调CD3^＋CD4^＋的表达，上调CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋的表达。     

沈阳市某学校教师的亚健康情况及外周血淋巴细胞亚群分析

目的统计沈阳市某学校教师的亚健康情况和分析亚健康状态时外周血淋巴细胞亚群的变化。方法采用现场调查的方法,对参加体检的教师发放亚健康调查表,判断教师健康状况。同时,检测健康教师和亚健康教师的淋巴细胞亚群。同期住院肿瘤患者淋巴细胞亚群结果作为对照。结果共有584名教师问卷合格,其中健康人群300例,患病需治疗的9例,亚健康状态人群275例,亚健康发生率为47.09%,健康教师淋巴细胞亚群分析中,总T细胞、辅助性T细胞(Th)、抑制性T细胞(Ts)、自然杀伤细胞(NK)和B细胞比例分别为(67.19±8.95)%、(37.58±7.23)%、(28.14±7.66)%、(21.16±9.97)%、(9.56±3.80)%。亚健康职工上述细胞比例分别为(65.22±7.75)%、(35.90±7.22)%、(28.87±8.02)%、(24.57±8.33)%、(9.61±4.66)%。同年度肿瘤患者上述细胞比例分别为(60.65±14.39)%、(30.32±15.22)%、(26.36±9.51)%、(30.25±13.36)%、(5.37±4.29%)。亚健康组与健康组比较总T细胞、Th、NK细胞比例差异均有统计学意义(P0.05),Ts及B细胞比例无明显差异。亚健康组与肿瘤组比较总T细胞、Th、Ts、NK细胞及B细胞比例差异均有统计学意义(P0.05),健康组与肿瘤组比较总T细胞、Th、Ts、NK细胞及B细胞比例差异均有统计学意义(P0.05)。结论教师亚健康状态的临床表现多样,其健康状况不容乐观。