基于vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究

目的建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的TaqMan实时荧光定量PCR。方法采用Primer Express软件,设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针,建立检测创伤弧菌vvhA基因100bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。采用基因克隆技术,构建作为阳性对照的pMD19-vvhA100重组质粒。以最低扩增循环数（Ct值）、荧光强度增加值（△Rn）为观察指标,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化。以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhA100为模板,对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证。创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠,验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果。结果所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果,其检测灵敏度可达0．01ng创伤弧菌DNA或10^3个拷贝的pMD19-vvhA100,不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的SD≤0．79,对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性。结论所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点,适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。     

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌（Vp）快速且特异的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green Ⅰ染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应：通过肉眼、SYBR Green Ⅰ染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15cfu／mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立

目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10~(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。     

环介导等温扩增技术快速检测HPV18方法的建立

目的应用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒18(HPV18)进行基因检测,建立一种快速、可视的HPV18核酸检测方法。方法针对HPV18病毒特异性E6区设计LAMP检测引物,通过调整反应物浓度建立LAMP反应体系,用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化判定。通过检测其他不同基因型别的病毒评估引物特异性,检测倍比稀释的临床标本确定其灵敏度,通过LAMP法检测临床标本验证其与PCR法的一致性。结果利用LAMP方法检测到HPV18病毒E6引物的特异性好,恒温65℃条件下反应60 min即可较好完成检测。LAMP特异性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×10~3拷贝/ml。LAMP可视化结果判定与PCR凝胶电泳结果相当,二者有较好的一致性(P0.05)。结论建立了HPV18病毒的LAMP快速、可视化检测方法,该法操作简便快捷,具有很好的开发应用前景。     

志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌LAMP检测方法的建立及应用

目的 建立针对侵袭性质粒抗原H(ipaH)编码基因的环介导等温扩增(LAMP)方法.方法 利用LAMP方法对4株志贺菌、1株肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和20株其他肠道菌DNA在65℃恒温扩增30 min或60 min后观察结果.结果 4株志贺菌和EIEC可通过肉眼和电泳观察到阳性结果,而其他肠道菌为阴性.LAMP检测特异性与聚合酶链反应(PCR)相似,但敏感性比PCR高10倍.LAMP、PCR检出下限分别为1.2×10 2、1.2×103 CFU/mL.LAMP和分离培养法对70例食物中毒患者和健康者肛拭子标本检测结果符合率为100％.结论 LAMP由于具有快速和无需特殊仪器的优点,可广泛用于肛拭子标本志贺菌和EIEC的检测.     

环介导等温扩增检测肺炎链球菌方法的建立及临床应用

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测肺炎链球菌的方法.方法 根据美国国家生物信息中心(GenBank)上提交的肺炎链球菌R6株的lytA基因序列(登录号AF2)08540)设计特异LAMP引物,以盐酸胍一苯甲醇法提取阳性血培养瓶中细菌DNA,然后以LAMP技术扩增lytA基因,反应条件为63℃45 min,采用肉眼观察浊度和琼脂糖电泳的方法来观察结果.结果 在196份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到肺炎链球菌16株,与传统方法比较,其检测肺炎链球菌的灵敏度和特异度均达到100%,且检测时间缩短为1 h左右.模拟标本的检测结果显示该方法的最低检测限为102CFU/ml.结论 该方法灵敏度高,特异性强,操作方便快速,适合从临床标本中检测肺炎链球菌.     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。     

快速检测大肠埃希菌LAMP方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)反应快速检测大肠埃希菌的方法。方法 根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)上大肠埃希菌的lacZ(登录号:M74750)基因序列,设计4条特异引物(2条内引物,2条外引物),对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化,采用琼脂糖电泳及肉眼观察结果。结果 将提取的13株细菌DNA进行LAMP反应,仅大肠埃希菌得到阳性结果,LAMP检测下限为15cfu/mL。结论 LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

多株创伤弧菌的基因分型和药敏试验

目的 了解海产品中分离的创伤弧菌的基因分子流行病学特征和药敏试验结果,为进一步研究创伤弧菌和临床用药提供依据。 方法 以聚合酶链反应(PCR)方法对海产品中分离的创伤弧菌进行核酸检测与基因型分型,用ATB细菌鉴定仪配套的药敏卡对创伤弧菌进行药敏试验。 结果 海产品中分离的创伤弧菌均为溶血素A基因(vvhA)核酸阳性,vcgC/E和16S rRNA A/B分型结果显示,共有5种基因型别,分别为CB型、CAB型、EA型、CA型和EAB型。共检测出1株BT2核酸阳性,1株SerE核酸阳性。药敏试验显示,该菌对氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素有耐药株。 结论 海产品中的创伤弧菌基因型呈多样性,以CB型为主,EAB型和CAB型同为国内首次报道的基因型。应加强对海产品中创伤弧菌的监测和耐药分析,预防创伤弧菌感染的暴发。     

E.coli O157：H7 LAMP检测方法的建立

目的建立检测E.coli O157：H7环介导的等温扩增方法（LAMP）。方法选取E.coli O157：H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157：H7 LAMP体系具有良好的特异性,用该体系对9属13种41株菌进行检测,结果只有E.coli O157：H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带,非E.coli O157：H7均未产生扩增产物,灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测,E.coli O157：H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%,2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157：H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题,而且检测方法简便、快捷,非常便于基层实验室和现场检测使用。     

快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法。方法针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物。采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价。同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较。结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性。LAMP最低检测限为10CFU/mL,灵敏度较高。对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P>0.05,χ2=0.1429)。结论本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测。     

Hemoculture and Direct Sputum Detection of mecA‐Mediated Methicillin‐Resistant Staphylococcus aureus by Loop‐Mediated Isothermal Amplification in Combination With a Lateral‐Flow Dipstick

This study reports loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of methicillin‐resistant Staphylococcus aureus from direct clinical specimens. Four primers including outer and inner primers were specifically designed on the two target sequences—femB to identify S. aureus and mecA to identify antibiotic‐resistant gene. Reference strains including various species of gram‐positive/gram‐negative isolates were used to evaluate and optimize LAMP assays. The optimum LAMP condition was found at 63°C within 70 min assay time (include hybridization with FITC probe for 5 min and further 5 min for reading the results on the lateral flow dipstick). The detection limits of LAMP for mecA was 10 pg of total DNA or 100 CFU/ml. The LAMP assays were applied to a total of 155 samples of direct DNA extraction from sputum and hemoculture bottles. The sensitivity of LAMP for mecA detection in sputum and hemoculture bottles was 93.3% (28/30) and 100% (52/52), respectively. In conclusion, LAMP assay is an alternative technique for rapid detection of MRSA infection with a technical simplicity and cost‐effective method in a routine diagnostic laboratory.     

浙江省舟山市售贝类中创伤弧菌的定量检测及毒力基因分析

目的 了解2010-2012年浙江省舟山市售贝类中创伤弧菌(Vibrio vulnificus,VV)的污染状况与季节性变化规律,及其毒力相关基因分型。 方法 采用3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌,纤维二糖一多粘茵素E(cc)琼脂分离贝类海产品中的创伤弧菌,可疑菌落的鉴定采用API20E,采用最近似值法(most probable number,MPN)进行创伤弧菌的定量检测,应用PCR技术进行生物Ⅰ型、Ⅱ型和血清E型鉴定,及vcg、16S rRNA毒力基因分型。 结果 179份样品检出64株创伤弧菌,检出阳性率为35.75%。不同季节检出率差异有统计学意义(2=35.23,P0.05),夏季检出率最高为68%。39株VV菌株为溶血素A基因(hemolysin gene A, vvhA)核酸阳性,1株BT2型,1株血清E型,其余37株均为BT1型。vcgC/E和16S rRNA A/B毒力基因分型结果显示:CB型 31株,CAB型4株,EA型 3株,EAB型 1株。 结论 舟山市售贝类中创伤弧菌的污染状况严重,尤其是夏秋季,毒力基因型呈多样性,以CB型为主。应对贝类的食品安全进行风险评估,预防食源性疾病的暴发。     

Detection of Klebsiella pneumonia in respiratory tract samples by the loop-mediated isothermal amplification method

目的:建立环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测呼吸道感染患者痰液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)的方法并进行初步应用。方法:基于Kpn phoE基因设计4条特异性引物,对反应条件中的Mg^2+和甜菜碱浓度进行优化,建立检测Kpn LAMP方法并进行特异性和灵敏度试验;收集308例呼吸道感染患者痰液样本,进行细菌培养法、LAMP法、DNA测序技术检测,评估LAMP检测体系。结果:8 mmol/L、0.4 mmol/L确定为Mg^2+和甜菜碱的最佳扩增浓度;该体系特异性强,与其他菌株无交叉反应,灵敏度为104 CFU/mL;临床样本中Kpn的LAMP检出率(53.89%)高于培养法(42.20%),差异有统计学意义(χ^2=161.65,P<0.05);LAMP法与细菌培养法在Kpn阳性样本、无细菌生长样本、非Kpn其他细菌阳性样本中的一致率分别为96.15%、100%、65.25%,46例不一致样本经DNA测序验证,LAMP法与测序符合率为86.95%(40/46);LAMP法和DNA测序法对131例样本同时进行检测,经Kappa检验两者具有极好的一致性(Kappa系数=0.817)。结论:与细菌培养法相比,LAMP法具有准确性高、灵敏度高、特异性强、反应省时等优势,可以作为肺炎克雷伯菌的快速检测方法。     

一株死亡患者分离的致死创伤弧菌菌株的耐药表型与分子特征

目的 对培养分离的创伤弧菌菌株(2014-DJH)进行耐药表型与分子特征分析。方法 采用全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行生化鉴定和耐药分析;采用PCR方法检测vvhA基因和pilF基因,及vcg和16S rRNA基因分型;应用多位点序列分析进行分子分型。结果 分离菌株2014-DJH经生化鉴定为革兰阴性的生物1型创伤弧菌;对大多数常用抗生素都敏感,对妥布霉素中度敏感;PCR检测vvhA和pilF阳性,为vcgC-16S rRNA B(CB)基因型;菌株的多位点序列型为glp 5、gyrB 3、mdh 32、metG 68、purM 21、dtdS 39、lysA 115、pntA 4、pyrC 42、tnaA 75。结论 菌株2014-DJH为新ST型菌株,命名为ST 289,注册号为id-389。基因分型结果表明该菌具有较强的致病能力,加强创伤弧菌感染的监测与预警具有重要的意义。     

恙虫病东方体环介导等温扩增可视化快速检测方法的建立

目的 利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术,建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法 利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4,以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列,设计扩增引物,优化反应条件。利用恙虫病东方体标准株评估灵敏度和特异度;收集42份恙虫病血样,分别采用LAMP、普通PCR和实时荧光定量PCR方法进行验证。结果 建立的LAMP方法可在61～65℃80 min内完成恙虫病东方体的快速检测,最低检测限为10拷贝/μL,高于普通PCR方法 2个数量级,高于荧光定量PCR方法 1个数量级;对8种常见的自然疫源性疾病病原体检测均为阴性,特异度为100%;对42份恙虫病血样采用3种方法检测,阳性率一致,均为21.4%(9/42)。结论 本研究建立的恙虫病东方体LAMP可视化检测反应快速,操作简便,灵敏特异,可在基层医疗卫生机构运用推广。