基于 LAMP技术针对溶藻弧菌 gyrB基因快速检测方法的建立

目的　应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）建立针对溶藻弧菌gyrB 基因的 快速检测方法。方法　以溶藻弧菌标准株（ATCC-17749）和溶藻弧菌野生株（WT）为研究对象,通过在线生物学软件（http:// primerexplorer.jp/e/）设计针对溶藻弧菌gyrB 基因的LAMP 引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快 速检测方法。结果　①经2g/dl 凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为 适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min 和90 min 凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min 能满足扩增需要; ③利用同一体系对临床6 种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀 释法验证该LAMP 体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论　建立了基于LAMP 技术针对溶藻弧菌gyrB 基因的快速检测方 法, 具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。     

快速检测大肠埃希菌LAMP方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)反应快速检测大肠埃希菌的方法。方法 根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)上大肠埃希菌的lacZ(登录号:M74750)基因序列,设计4条特异引物(2条内引物,2条外引物),对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化,采用琼脂糖电泳及肉眼观察结果。结果 将提取的13株细菌DNA进行LAMP反应,仅大肠埃希菌得到阳性结果,LAMP检测下限为15cfu/mL。结论 LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

目的建立一种海洋致病性弧菌的快速诊断方法,为海洋性弧菌感染的临床检测构建新的技术平台。方法分别针对创伤弧菌vvh A,副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因设计扩增引物和测序引物,并PCR扩增特异性DNA片段,制备单链模板,进行焦磷酸测序,得到的碱基序列经NCBI比对验证;对创伤弧菌16S rRNA基因进行分型。结果创伤弧菌的扩增引物和测序引物均表现出较好的特异性,4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段,并且测序结果与NCBI比对达到100%匹配度,而其他菌株未见扩增条带,测序结果为阴性;11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分别扩增出105 bp和134 bp大小的DNA片段,并且经测序得到与预期相符的DNA碱基序列。4株创伤弧菌中1株属于16S rRNA-A型,其余3株均属于16S rRNA-B型。结论本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是一种短核苷酸序列实时测定的新方法,具有高通量、精确、简单易行的优点,适用于海洋性致病菌及陆地感染细菌的快速精准鉴定。     

肠道病毒71型RT-LAMP快速检测方法的建立及初步应用

目的建立手足口病肠道病毒71型(EV71型)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法,并对其进行应用评价。方法利用软件针对EV71型病毒特异性基因6个区域设计4条LAMP引物,在普通恒温水箱内65℃保温约1 200min完成RT-LAMP扩增,扩增结果通过电泳和肉眼来判断。利用RT-LAMP和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法同时检测70份EV71型肠道阳性标本;将EV71型的RNA做一系列10倍稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感度。结果 EV71型出现LAMP特征性梯状条带,肉眼可以判断结果;RT-LAMP与RT-PCR方法检测100份EV71型标本的检出率比较差异无统计学意义(P0.05);RT-LAMP方法的敏感度(10.0pg/μL)与RT-PCR方法相同。结论建立了一个可以在普通恒温水箱内进行核酸扩增的EV71型RT-LAMP检测方法,初步应用证实该方法有一定的应用前景。     

生殖支原体环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立检测生殖支原体(M.genitalium,Mg)的环介导等温扩增方法。方法根据Gen Bank公布的Mg核苷酸序列,设计4条特异性引物,进行PCR反应,对内、外引物浓度,d NTPs和Mg SO4浓度及Bst DNA聚合酶用量等进行优化,建立Mg LAMP的检测方法并进行特异性和敏感性评价;对20份HIV感染者的DNA样本分别进行LAMP和常规PCR检测。结果内、外引物浓度分别为1.6和0.2μmol/L,d NTPs浓度为1.6 mmol/L,Mg SO4浓度为12 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为8 U时,LAMP反应效果较好;用该体系检测同源关系较近的穿通支原体(M.penetrans,Mpe)、梨支原体(M.pirum,Mpi)均呈阴性;对Mg的检测灵敏度可达10-7;20份HIV感染者用LAMP法及常规PCR法各检出Mg阳性标本5份,两法的检测结果一致。结论建立的Mg LAMP检测方法的特异性、灵敏度较好,成本低廉,适合临床应用。     

环介导等温扩增技术(LAMP)在肺结核诊断中的应用研究

目的探讨环介导等温扩增技术(LAMP)在肺结核病的诊断中的应用。方法收集140例本院临床诊断为肺结核病或者怀疑为肺结核患者的痰液标本,分别用涂片抗酸染色法、LAMP法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性检出率、敏感性和特异性。结果 140份痰标本中涂片抗酸染色法、LAMP法和改良罗氏培养法的阳性检出率分别是25.71%(36/140)、43.57%(61/140)和41.43%(58/140)。LAMP法的阳性检出率明显高于涂片法,差异有统计学意义(P0.05)。以改良罗氏培养法为金标准,并结合临床诊断及患者使用抗结核药物的反应性综合判断,LAMP法的敏感性是87.93%(51/58),特异性是87.80%(72/82),两种方法检测结果的一致性κ=0.752,说明LAMP法在检测结核分枝杆菌方面与罗氏培养法有较好的吻合性。结论 LAMP法在检测痰标本中的结核分枝杆菌方面有着比较高的敏感性和特异性,在结核病的快速诊断上具有优势。     

E.coli O157：H7 LAMP检测方法的建立

目的建立检测E.coli O157：H7环介导的等温扩增方法（LAMP）。方法选取E.coli O157：H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157：H7 LAMP体系具有良好的特异性,用该体系对9属13种41株菌进行检测,结果只有E.coli O157：H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带,非E.coli O157：H7均未产生扩增产物,灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测,E.coli O157：H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%,2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157：H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题,而且检测方法简便、快捷,非常便于基层实验室和现场检测使用。     

环介导等温扩增技术快速检测脑膜炎奈瑟菌属方法的建立

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种快速敏感的脑膜炎奈瑟氏菌属检测方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌属(ctrA)基因序列的6个区域设计4条LAMP引物(2条内引物、2条外引物),同时设计2条环引物,并对反应条件和反应体系进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与普通PCR进行了比较。结果在适宜反应条件所设计引物对脑膜炎奈瑟菌的扩增的特异性及敏感性均较好,与普通PCR方法比较,LAMP敏感性比普通PCR高10倍。结论 LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应。实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜炎奈瑟氏菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用。     

环介导等温扩增在病原诊断中应用

经典的病原检测和诊断方法是体外培养和显微镜技术,这种方法在临床实验室仍然是一项核心技术。但由于临床上很多病原体难以被选择培养,从而限制了它们的诊断。尤其在发展中国家,这种敏感性较低的抹片显微镜检查往往会延误治     

环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测临床标本中金黄色葡萄球菌(SA)的方法.方法 基于金黄色葡萄球菌femA基因部分序列设计一套(共4条)特异性引物,包括特异性识别靶序列上6个不同区域的两条内引物和两条外引物.通过条件优化,建立检测SA的LAMP方法.用该法检测临床分离的40株SA、12种其他革兰阳性球菌和...     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

Validation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of pertussis infection in nasopharyngeal samples

Objective: To develop and validate a novel loop-mediated amplification (LAMP) assay for rapid diagnosis (<1 hour) of whooping cough in nasopharyngeal samples versus the gold standard: real-time PCR.

Methods: The study included all nasopharyngeal samples (n = 213) collected from children with clinical suspicion of pertussis admitted to Children’s University Hospital Sant Joan de Déu (Barcelona, Spain) during July–December 2014. Fresh samples were routinely analyzed by real-time PCR and stored for retrospective LAMP analysis, following an easy 30 minute DNA extraction step by Chelex-100.

Results: Performance results of the LAMP assay were: linearity, 10⁵–10¹ CFU/ml; Limit of Detection, 2 CFU/ml; precision (mean CV), 7.38%; diagnostic sensitivity, 96.55%; diagnostic specificity, 99.46%; time to detection, 12–30 minutes.

Conclusion: The new test was shown to be 2.5-fold faster than real-time PCR while maintaining similar levels of analytical and clinical performance. Therefore it could become a useful diagnostic tool for molecular point-of-care testing.     

副溶血弧菌的gyrB基因环介导的恒温扩增技术检测方法的研究

目的建立一种适合基层实验室应用和开展的快速检测副溶血弧菌的DNA环介导的恒温扩增法(LAMP)。方法针对副溶血弧菌的IgyrB/I 基因序列设计了4条引物（2条内引物、2条外引物）,并对扩增反应条件进行了优化。结果整个检测过程仅需1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检 测判断结果;对3株种系背景明确的副溶血弧菌不同实验对照株、23株副溶血弧菌地方分离株和32株其他肠道菌进行了检测,具有很高的特异性 ;该方法的最低检测限为24 cfu/ml,具有良好的敏感性;应用于61份贝类海产品的现场检测,阳性率为100%,与实时荧光定量PCR方法的检测 结果相符,阳性率高于传统的培养鉴定方法。结论本方法具有快速、灵敏、特异、简便、经济等特点,适合基层实验室、应急检测或现场监测 等使用,具有较高的推广价值。     

Sensitively and quickly detecting Vibrio vulnificus by real time recombinase polymerase amplification targeted to vvhA gene

Vibrio vulnificus (V. vulnificus) is a Gram-negative bacterium living in warm and salty water. This marine bacterium could produce hemolysin (VVH), which often causes serious gastroenteritis or septicemia when people contact to seawater or seafood containing V. vulnificus. Timely diagnosis is regard as essential to disease surveillance. In this paper, we aimed at developing a quick and sensitive method for the detection of Vibrio vulnificus using real time recombinase polymerase amplification (real time RPA). Specific primers and an exo probe were designed on the basis of the vvhA gene sequence available in GenBank. Target DNA could be amplified and labeled with specific fluorophore within 20 min at 38 °C. The method exhibited a high specificity, only detecting Vibrio vulnificus and not showing cross-reaction with other bacteria. The sensitivity of this method was 2 pg per reaction (20 μL) for DNA, or 200 copies per reaction (20 μL) for standard plasmid. The detection limit (LOD) stated as the target level that would be detected 95% of the time and estimated was 1.58 × 10² copies by fit of the probit to the results of 8 replicates in different concentration. For quantitative analysis of the real time RPA, the second order polynomial regression was adopted in our study. The results showed the correlation coefficients were raised above 0.98, which suggested this model might be a better choice for the quantitative analysis of real time RPA compared to the routine linear regression model. For artificially contaminated plasma samples, Vibrio vulnificus could be detected within 16 min by real time RPA at concentration as low as 1.2 × 10² CFU/mL or 2.4 CFU per reaction (20 μL). Thus, the real time RPA method established in this study shows great potential for detecting Vibrio vulnificus in the research laboratory and disease diagnosis.     

基于环介导恒温扩增法快速检测破伤风梭菌

目的 利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测破伤风梭菌的方法,以便对破伤风梭菌感染进行快速检测.方法 (1)设计针对破伤风梭菌的环介导恒温扩增检测方法.(2)对破伤风梭菌恒温扩增法进行特异性试验.(3)对破伤风梭菌恒温扩增法进行灵敏度试验.结果 (1)设计出针对破伤风梭菌的恒温扩增检测方法.(2)本恒温扩增检测方法只扩增...     

环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸

摘要:目的：建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌（MTB）核酸的环介导等温扩增（LAMP）方法。 方法：以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸。用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查。 结果：LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸;灵敏度高,检测限达100 fg;而实时荧光PCR检测限为1 pg。对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28%、39%和38%。 结论：本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法。     

利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌

目的利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测溶组织梭菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于气性坏疽临床现场检验。方法通过基因比对与引物设计,设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法。检测该LAMP方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况,对其特异性进行评价。(3)检测该LAMP方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况,观察其最低检测限,对其灵敏度进行评价。结果设计出针对溶组织梭菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只针对溶组织梭菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性。该LAMP检测方法对溶组织梭菌的最低检测限为1×101CFU/mL,显示其灵敏度较高。结论该试验设计出了针对溶组织梭菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度,能够用于溶组织梭菌的临床现场检验。