血小板激活因子受体mRNA在小鼠附睾精子内的表达

目的 检测血小板激活因子受体（ＰＡＦＲ）ｍＲＮＡ在小鼠附睾精子内的表达,探讨ＰＡＦＲ对受精过程的影响。２方法 分离提高小鼠附睾精子ｍＲＮＡ,经逆转录（ＲＴ）合成ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列分析验证扩增产物的准确性。结果 小鼠附睾精子表达ＰＡＦＲ－ｍＲＮＡ;ＤＮＡ序列分析验证ＰＣＲ产物的小鼠ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。④结论 小鼠附睾精子有ＰＡＦＲ－ｍＲＮ     

慢性铝暴露对小鼠精子质量及睾丸细胞焦亡的影响

目的 研究铝暴露对小鼠精子质量及睾丸细胞焦亡的影响。方法 将12只成熟雄性c57bl/6j小鼠分为两组：对照组(n=6)、铝模型组(n=6),对照组用蒸馏水灌胃，铝模型组采用10 mg/(kg·d) AlCl₃灌胃，8周后，获取小鼠睾丸组织、附睾组织及附睾精子。对附睾精子进行精子质量分析，对睾丸及附睾HE染色进行病理检测；运用PCR、免疫组化检测睾丸组织细胞焦亡关键基因的mRNA和蛋白表达。结果 与对照组相比，铝暴露的小鼠睾丸重量、附睾重量、精子活力、精子数量均显著下降(P<0.01),精子畸形率显著增加(P<0.01)。睾丸形态学观察结果显示，铝暴露小鼠睾丸生精小管中细胞排列紊乱，生精小管的面积和直径减小，管内精子减少。PCR及免疫组化结果显示，铝暴露小鼠睾丸组织中焦亡关键基因Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd和IL-1b的mRNA及蛋白表达均上调(P<0.01)。结论 铝暴露可降低小鼠的精子质量，促进睾丸细胞焦亡，从而损伤雄性生殖系统。     

黑素瘤抗原-a基因在煤焦沥青烟气诱发小鼠肺癌组织中的表达及其意义

目的：探讨煤焦沥青（CTP）烟气诱发小鼠肺癌组织中黑素瘤抗原－a(mage-a)基因mRNA的表达及其意义。方法：CTP烟气诱发小鼠肺癌，提取癌组织中RNA，用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－PCR）方法对癌组织和相应癌旁组织mage-a mRNA表达情况进行研究；pUC18质粒克隆，大肠杆菌DH5α转化；PE－377DNA测序仪对2个阳性克隆中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：实验组29只小鼠中8只诱发出肺癌（8／29）；8只小鼠肺癌中，有5只癌组织mage-a mRNA表达阳性（5／8）；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明扩增产物中目的基因片段均为mage-a cDNA序列。结论：小鼠肺癌组织中mage-a mRNA呈高比例表达，CTP烟气诱发小鼠肺癌可能是MAGE－A抗原肺癌免疫治疗的理想模型。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

N-甲基亚硝基脲诱导小鼠胸腺淋巴瘤TCR基因重排分析

目的探讨N-甲基亚硝基脲(MNU)诱导的小鼠胸腺淋巴瘤的单克隆起源。方法采用巢式PCR方法,对8例MNU诱导的胸腺淋巴瘤组织进行T细胞受体β链(TCRβ)和γ链(TCRγ)克隆性基因重排分析,并对TCRγ基因重排的PCR产物直接测序。结果 8例胸腺淋巴瘤检测TCRβ和TCRγ均呈克隆性基因重排。DNA序列测定证实TCRγ基因PCR扩增产物为基因重排产物。结论巢式PCR TCR基因重排检测及DNA序列分析证实,MNU诱导的小鼠胸腺淋巴瘤是来源于T细胞的肿瘤。     

HSP90β在小鼠生殖系统中的表达及调控

目的研究热休克蛋白90β（HSP90β）在小鼠睾丸、附睾、精子中的表达及调控机制。方法从mRNA和蛋白水平上对
HSP90β在小鼠睾丸和附睾组织细胞中及精子上表达及定位进行分析,同时对其基因在雄性生殖中的表达调控进行初步探索。结
果HSP90β mRNA在小鼠附睾中的表达量比在睾丸中高。在小鼠精子中定位于顶体部位。其基因在去势小鼠的附睾中表达降
低,补充睾酮后又恢复正常,在发育中小鼠的睾丸、附睾中表达也有变化。结论HSP90β在小鼠精子形成及受精中可能发挥重要
作用;其在去势小鼠附睾中和在出生后不同阶段小鼠睾丸、附睾中的表达模式,说明其基因表达受激素调控和发育调控的影响。
     

Prss37基因转录起始位点的确定及其转录调控的初步探讨

目的 确定Prss37基因的转录起始位点,并利用转基因技术在整体水平验证该启动子的组织特异性.方法 运用cDNA 5'末端快速扩增法(5' RACE)对C57BL/6J小鼠睾丸mRNA进行分析,确定Prss37的转录起始位点;构建Prss37内源启动子区域转录起始位点上游不同长度DNA片段(1 kb、2 kb、4 kb)驱动的荧光素酶基因表达的质粒;通过受精卵雄原核显微注射技术获得上述三种启动子驱动荧光素酶基因表达的转基因小鼠;利用活体成像技术观察荧光素酶基因的表达,明确启动子的组织特异性.结果 Prss37基因的转录起始位点位于NCBI GeneBankTM(NM_026317.2)报道序列上游的40 bp处;成功获得三种转基因小鼠,其中1kb启动子驱动的转基因小鼠检测到荧光素酶基因的表达,且在脑、睾丸和附睾组织中的表达较强.结论 明确Prss37的转录起始位点,成功获得了睾丸和附睾表达荧光素酶基因的转基因小鼠,为进一步的Prss37基因转录调控研究奠定了基础.     

rsistin基因的克隆及载体的构建

目的:克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建,为进一步研究resistin的功能打下基础。方法:根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因,即提取小鼠脂肪组织中的RNA,以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,逆转录(RT)合成resistinDNA,再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应(PCR)扩增resistin cDNA,将扩增PCR产物(resistin cDNA)经纯化后与A-T连接于pGEM-T载体,重组质粒转化JM109感受态菌,蓝白斑筛选阳性菌落,摇菌、提取质粒。结果:提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28s∶18s比例约为2∶1,RT-PCR与欲扩增的目的片段的理论长度363bp相符,重组质粒插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论:成功克隆了小鼠resistin cDNA基因,为构建resistin基因打下基础。     

hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义

目的 构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体.方法 提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定.结果 PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段.该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定,证实hURAT1片段插入序列和方向正确.结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确,可用于后续基因功能研究,尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究.     

结直肠癌组织趋化因子IL-8的表达

目的：研究结直肠癌组织趋化因子IL－8的表达与结直肠 生物学行为的关系。方法：采用RT－PCR方法检测临床收集的新鲜结直肠癌组织标本中趋化因子IL－8mRNA的表达;采用免疫组织化学方法检测结果直肠癌组织中趋化因子IL－8蛋白的表达。结果：12例结直肠癌组织经RT－PCR检测均可出现趋化因子IL－8mRNA的表达。40例结肠癌组织IL－8蛋白表达的阳性率为87．5％;结直肠癌组织IL－8蛋白的表达与结直肠癌的转移及Dukes分期有关,表达强者,转移发生率高,Dukes分期晚。结论：结直肠癌组织中趋化因子IL-8的表达与结直肠癌的生物学行为有关。     

黑色素瘤抗原-1基因在胃癌组织中的表达

①目的检测黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因在胃癌组织中的表达，为应用MAGE-1基因产物对胃癌病人进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。②方法用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE-1基因的表达，并对1例RT-PCR阳性扩增产物进行DNA序列测定。③结果30例胃癌组织标本中有14例(46．7％)表达MAGE-1基因，而相应的癌旁组织均不表达MAGE-1，两组比较差异有显著性(P=0．001)；DNA序列测定证实1例RT-PCR扩增产物中的目的基因片段为MAGE-1 cDNA序列。④结论MAGE-1基因在胃癌组织中有较高表达，这使得以该基因编码蛋白作为疫苗用于胃癌的免疫治疗成为可能。     

喉癌病人外周血单个核细胞中MMP-9 mRNA的表达

①目的　探讨喉癌病人外周血单个核细胞 (PBMC)中基质金属蛋白酶 9(MMP 9)mRNA的表达情况。②方法　提取PBMC中的总RNA ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,检测 5 8例喉癌病人PBMC中MMP 9mRNA表达 ,并以 2 0例正常人作为对照。③结果　不同分期喉癌病人PBMC中MMP 9mRNA表达均明显高于对照组 ,差异有极显著性 (F =187.75 ,q =6 .13～ 33.38,P <0 .0 1) ,并随临床分期及病理组织分级增加而表达增强 (F =187.75、193.12 ,q=8.94～ 30 .95 ,P <0 .0 1)。④结论　喉癌病人PBMC中MMP 9mRNA表达水平可作为喉癌预后的一项预测指标     

反义脱氧寡核苷酸诱导HL-60细胞分化及对c-myc基因表达的影响

目的 研究二个针对c-myc基因的反义脱氧寡核苷酸（简称反义核酸）对急性白血病细胞HL－60的分化及基因表达的作用。方法 以人工合成二个硫代寡核苷酸作用于HL－60细胞后,采用流式细胞仪检测c-myc蛋白表达和HL－60细胞分化抗原,RT－PCR方法检测c-myc基因表达,并在光镜下观察以瑞特染色及NBT染色的HL－60细胞形态。结果 经反义核酸作用后,c-myc蛋白的表达有明显下降,与作用浓度与时间相关。急性白血病HL－60细胞出现中,晚幼粒细胞增多,出现CD15增高,HLA－DR及CD34降低是细胞分化的表现。同时RT－PCR分析c-myc基因扩增明显减少。结论 反义核酸对急性白血病细胞HL－60的诱导分化的同时抑制c-myc基因表达。     

喉组织中HPV11,16 E6基因DNA及HPV16 E6 mRNA的定量检测

①目的探讨人乳头瘤病毒11,16型(HPV11,16)转化基因E6 DNA及HPV16 E6 mRNA与喉疾病严重程度的关系.②方法分别用竞争性聚合酶链反应(CPCR)和半定量RT-PCR技术检测喉乳头状瘤、喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量.③结果喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量均高于喉乳头状瘤组织,差异有显著性(t=3.745,2.776,2.759, P<0.01,0.05);高、中、低分化喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA含量无显著性差异(F=0.335, 0.234, P>0.05),但低分化喉鳞癌组织中HPV16 E6 mRNA的表达水平显著高于高分化喉鳞癌(F=4.219,q=4.107, P<0.05).④结论 HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量有随病理程度加重而增高的趋势,从分子水平探讨转化基因E6的致癌性, 有助于阐明HPV与喉癌发生发展的关系.     

水通道蛋白亚型AQP1-9在雄性小鼠生殖系统mRNA的表达

目的：明确AQP1-9在雄性小鼠生殖系统的分布与表达。方法：应用RT-PCR技术检测AQP1-9在雄性小鼠生殖系统不同器官的表达。结果：在成年雄性小鼠的生殖系统中，有多种水通道的表达，睾丸中有AQP3、5、7、8、9表达；附睾头中有AQP3、6、8表达；附睾尾有AQP3、5、6、7、8表达；输精管中有AQP1、2、3、4、5、6、7的表达。结论：小鼠生殖系统中多种水通道蛋白的表达提示AQP与生殖功能有密切关系。     

阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义核酸在K562细胞的摄入和胞内分布的影响

目的探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响. 方法采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平. 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平. 结论阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制.     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。     

五种多药耐药性基因在正常人体组织的表达

目的：观察五种多药耐药性（MDR）基因在正常人体组织中的表达。方法：采用二重RT-PCR法及免疫组织化学SP法，分别从mRNA和蛋白质表达水平检测（90例，共15种）正常人体组织中5种MDR基因的表达。结果：五种MDR基因在人体不同器官和组织中均有表达。同时表达5种MDR基因的器官和组织有肝脏、肺脏、肾脏、食管、结肠、小肠、胰腺、甲状腺、前列腺及胎盘。皮肤组织中未发现LRP基因表达（0/5）。乳腺和卵巢组织未发现MRP基因表达（0/5）。不同MDR基因在各种组织中的表达存在差别。结论：正常情况下，五种MDR基因的mRNA和蛋白质在人体组织中广泛表达，以在肝脏、肺脏、肾脏、结肠、小肠和胰腺组织中表达较强。