小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1( )质粒上,mIL-12受pcDNA3.1( )中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1( )-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1( )-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

pcDNA3.1(+)-mIL-12在Lewis细胞中生物活性的探讨

目的:建立稳定表达小鼠IL-12(mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mIL-12,脂质体转染LLC细胞并测其表达,流式细胞仪(FCM)观察细胞周期和凋亡,G418筛选获得阳性克隆后大量培养并检测mIL-12活性。结果:pcDNA3.1(+)-mIL-12质粒构建正确并成功转导入LLC细胞,重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12,mIL-12使LLC细胞周期重新分布,并促进其凋亡。LLC/mIL-12细胞培养上清能明显引起刀豆蛋白A(ConA)激活的小鼠脾细胞增殖。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达质粒,建立具有mIL-12生物学活性的LLC细胞系。     

Bcl-2基因在人膀胱癌细胞中表达对CTL凋亡诱导作用的影响

目的:探讨Bcl-2基因在人膀胱癌细胞中表达对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)凋亡诱导作用的影响。方法:采用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/Bcl-2;应用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3.1(+)/Bcl-2导入膀胱癌BIU-87细胞,RT-PCR检测Bcl-2基因表达水平;不同浓度抗Fas单克隆抗体(Anti-Fasmab)模拟CTL的Fas-配体(Fas-L)处理转染与未转染Bcl-2基因的膀胱癌细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、吖啶橙(AO)荧光染色法和流式细胞检测仪(FCM)分析细胞存活和凋亡情况。结果:酶切和核酸测序证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Bcl-2构建成功。将重组质粒转染膀胱癌细胞后,RT-PCR分析表明,转染Bcl-2基因的BIU-87/Bcl-2细胞的Bcl-2基因表达水平较BIU-87细胞和转染空载体的BIU-87/neo细胞显著增高,P<0.01。An-ti-Fasmab作用后,BIU87/Bcl-2细胞的存活率显著高于BIU-87和BIU-87/neo细胞,P<0.05或P<0.01。3种细胞虽均发生凋亡的形态学改变,但BIU87和BIU87/neo细胞改变更为明显,两者的凋亡率分别为(25.33±3.00)%和(27.05±1.75)%,而BIU-87/Bcl-2细胞的凋亡率为(18.06±1.41)%,显著低于前两者,P<0.01。结论:Bcl-2基因高表达通过阻断CTL杀伤膀胱癌细胞的Fas/Fas-L途径,使膀胱癌细胞能够抵御免疫系统中CTL的攻击。     

pcDNA3.1-KISS-1真核表达载体的构建及其对EC1细胞转移的抑制作用

 目的 克隆人食管组织KISS-1基因及构建真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,并观察其在食管癌EC1细胞中的表达及对EC1细胞侵袭及运动能力的影响。 方法 从人正常食管组织中提取总RNA,设计特异性引物,通过逆转录聚合酶联链反应（RT-PCR）扩增KISS-1基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-KISS-1,酶切鉴定及测序分析后用Lipofectamine脂质体将其转染到食管癌细胞,Western blot法检测其蛋白在EC1细胞中的表达情况;应用细胞运动实验及重建基底膜侵袭实验分析KISS-1表达对EC1细胞运动和侵袭能力的影响。 结果 成功克隆了人KISS-1基因全长编码序列,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-KISS-1,脂质体转染后KISS-1基因在EC1细胞中成功表达;转基因组细胞的运动能力（174.6±14.24）和体外穿越重建基底膜的能力（90.44±12.83）明显低于转空质粒组（222.6±30.08,110.22±15.87）和对照组EC1细胞（234.40±14.72,124.78±18.14）（P均<0.05）。 结论 重组pcDNA3.1-KISS-1真核表达质粒构建成功,并且KISS-1对食管癌细胞的侵袭和运动能力具有抑制作用。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

C14orf166异位表达对Hela细胞增殖与迁移能力的影响

目的:研究C14orf166异位表达对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响.方法:构建C14orf4166真核表达载体并转染Hela细胞,采用RT-PCR及蛋白质印迹法技术检测基因表达,用MTT、Transwell的方法检测C14orf166蛋白在Hela细胞的异位表达对其增殖和迁移能力的影响.结果:成功构建pcDNA3.1-C14orf166真核表达载体并使其在Hela细胞中大量表达,初步研究发现重组质粒转染组与空质粒转染组相比,细胞迁移能力增强,细胞穿膜数分别为39.6±11.7和25.7±8.6,而细胞增殖能力并没明显变化.结论:获得了真核表达载体pcDNA3.1-C14orf166,初步证实C14orf166表达能促进Hela细胞的迁移,为进一步研究c14orf166的功能奠定了基础.     

miR-155对人肺癌95D细胞生物学行为的影响

目的：构建携microRNA-155（miR-155）的真核表达载体并观察其转染高转移性人巨细胞肺癌95D细胞后细胞的生物学行为变化。方法：以95D细胞基因组RNA为模板,经PCR法扩增miR-155的前体序列,由 Bam HⅠ和 Hin dⅢ双酶切后将其亚克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),并进行双酶切及测序鉴定;将构建成功的pcDNA3.1(-)-pri-miR-155载体（命名为p-miR-155）体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用 Real-time PCR探针法检测miR-155成熟体的表达水平,并利用CCK-8法、克隆形成实验和划痕法检测95D细胞的增殖、克隆形成以及体外迁移能力。 结果： 成功构建携miR-155的真核表达载体;与空白（Mock）和对照组（p-Ctrl）相比,转染后的95D细胞过表达miR-155\[（2.04±0.62) vs (0.76±0.62)、(1.00±0.45),均 P <0.01\]、p-miR-155载体转染组95D细胞的增殖抑制明显增加\[(46.70±6.89)% vs （3.70±1.40）%、（1.11±0.75）%, P <0.01\]、克隆形成能力（在100和1 000个细胞/孔接种条件下）明显下降\[（12±3) s (34±3)、(35±3)个, P <0.01;(78±4) vs (159±4)、(165±4)个, P <0.01）\],此外,细胞的迁移细胞数也明显减少\[(110±5) vs (295±5)、(325±5)个, P <001\]。 结论： 通过miR-155真核表达载体转染产生的过表达miR-155可显著抑制人肺癌95D细胞的增殖和迁移能力。     

肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1a反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制.方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1a反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定.反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1a1组、H22/antiIL-1a2三组,RT-PCR检测IL-1a的表达水平.以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性.结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1a反义RNA的表达载体pafpIRES2-antiIL-1a1和pafpIRES2-antiIL-1a2,转染H22细胞后细胞中IL-1a表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1a2更为显著.成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比, H22/antiIL-1a2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05). H22/antiIL-1a1、H22/antiIL-1a2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01).结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1a反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1a表达、上调NK细胞的杀伤活性有关.     

VEGF-C基因转染对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨脂质体介导VEGF-C基因转染对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响.方法双酶切pCRⅡ-VEGF-C重组质粒获得人VEGF-C cDNA片段,与真核表达载体pcDNA3.1连接构建pcDNA3.1-VEGF-C重组质粒,脂质体介导转染人胃癌OCUM-2MD3细胞并筛选,RT-PCR检测转染后VEGF-CmRNA表达水平,免疫组化法、流式细胞术检测VEGF-C蛋白表达变化.结果经酶切鉴定,pcDNA3.1-VEGF-C重组质粒含人VEGF-CcDNA.转染组VEGF-CmRNA相对吸光度值为(0.73±0.16)%,较空载组(0.54±0.13)%表达显著上调(P＜0.01).免疫组化和流式细胞术检测转染组VEGF-C蛋白阳性表达率分别为(52.16±6.72)%、(41.83±3.65)%,较空载组(30.33±5.04)%、(30.16±3.23)%显著增加(P＜0.01或0.05).结论脂质体介导VEGF-C基因转染人胃癌OCUM-2MD3细胞可显著增加VEGF-C表达水平,对探索胃癌淋巴转移机制及其治疗具有重要意义.     

Pharmacogénétique des fluoropyrimidines. La méthylènetétrahydrofolate réductase

Résumé: Lefficacité optimale des fluoropyrimidines nécessite des concentrations élevées en 5-10 méthylènetétrahydrofolate (CH₂FH₄), contrôlées par la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR) qui convertit irréversiblement le CH₂FH₄ en 5-méthyltétrahydrofolate (CH₃FH₄). Les polymorphismes 677CT et 1298AC du gène MTHFR sont associés à une baisse dactivité de lenzyme. Les tumeurs «MTHFR mutées» devraient donc être plus sensibles aux fluoropyrimidines que les tumeurs «MTHFR sauvages». Les études expérimentales et cliniques publiées à ce jour tendent à montrer une plus grande sensibilité au 5-FU (associé ou non à lacide folinique) dans les tumeurs MTHFR mutées par rapport aux tumeurs sauvages. Ces résultats montrent la nécessité de poursuivre ces recherches afin de confirmer limpact de ces polymorphismes sur lefficacité des fluoropyrimidines.     

Oncogénétique et psycho-oncologie, une collaboration recommandée...

Résumé: La possibilité depuis 1994, de connaître la probabilité individuelle de développer certains cancers a permis de proposer de nouvelles modalités de prévention, de traitements et contribué au développement actuel de loncogénétique. Une meilleure connaissance des répercussions psychologiques tant pour les patients que pour les apparentés est désormais possible et limplication des psycho-oncologues dans ce cadre de la réalisation des tests prédictifs, recommandée. La mission de «messager» qui incombe au «cas-index» doit faire lobjet dune attention particulière. La complexité de linformation et la dimension paradoxale que peut avoir parfois la communication à propos des choix, rend difficile lévaluation de la qualité du consentement. La situation particulièrement délicate dune aide à la décision à légard de la chirurgie prophylactique, exige une collaboration étroite des généticiens et des psycho-oncologues.Les soins de support en oncologie     

The role of papillomaviruses in human cancers

This review comprehensively evaluates the influence of gene-gene, gene-environment and multiple interactions on the risk of colorectal cancer (CRC). Methods of studying these interactions and their limitations have been discussed herein. There is a need to develop biomarkers of exposure and of risk that are sensitive, specific, present in the pathway of the disease, and that have been clinically tested for routine use. The influence of inherited variation (polymorphism) in several genes has been discussed in this review; however, due to study limitations and confounders, it is difficult to conclude which ones are associated with the highest risk (either individually or in combination with environmental factors) to CRC. The majority of the sporadic cancer is believed to be due to modification of mutation risk by other genetic and/or environmental factors. Micronutrient deficiency may explain the association between low consumption of fruit/vegetables and CRC in human studies. Mitochondrial modulation by dietary factors influences the balance between cell renewal and death critical in colon mucosal homeostasis. Both genetic and epigenetic interactions are intricately dependent on each other, and collectively influence the process of colorectal tumorigenesis. The genetic and environmental interactions present a good prospect and a challenge for prevention strategies for CRC because they support the view that this highly prevalent cancer is preventable.     

Antifungal combination therapy in localized candidosis

A mouse model of localized candidosis in air-filled subcutaneous cysts imitating thrush has been developed. We have now tested various antifungal combinations in this animal model. Flucytosine (5-FC) + amphotericin B (Amph B) showed the highest efficacy, a clear additive or even synergistic effect was seen. The combination of 5-FC + imidazole or triazole derivative was less efficacious, an additive effect was rare. The combination of 5-FC + Amph B was also tested against Candida albicans strains showing various degrees of 5-FC-resistance. A significant reduction in 5-FC-resistant mutants was seen after the treatment with the combination.     

Les génériques en cancérologie: à molécule identique, médicaments identiques? Les biosimilaires, des super-génériques?

Résumé: Les biosimilaires vont bientôt voir leur apparition en Europe. Comment un laboratoire peut-il aborder le développement de son dossier dAMM? Quelles sont les bases légales et les recommandations officielles? Comment la similarité et/ou le caractère générique peuvent-ils être démontrés? Les règles sont-elles identiques à celles des produits chimiques conventionnels pour lesquels, notamment en cancérologie, il existe des médicaments génériques? Comment faire pour que la sécurité et lefficacité des médicaments biosimilaires soient assurées pour les patients?     

PSA-Test zur Früherkennung des Prostatakarzinoms

Zusammenfassung Prostatakrebs ist hierzulande seit einigen Jahren die häufigste Krebserkrankung bei Männern. Da über die Ätiologie wenig gesichertes Wissen vorliegt und daher kaum Möglichkeiten zur primären Prävention bestehen, konzentrieren sich die Anstrengungen auf die Suche nach wirksamen Verfahren zur sekundären Prävention. Hierbei gilt die Verwendung des PSA-Tests zur Früherkennung des Prostatakarzinoms als derzeit aussichtsreichstes Verfahren. Bevor ein neues Früherkennungsverfahren zur breiten Anwendung empfohlen oder in das gesetzliche Früherkennungsprogramm aufgenommen wird, muss jedoch seine Wirksamkeit in hierfür geeigneten wissenschaftlichen Untersuchungen nachgewiesen werden. Bis jetzt gibt es bereits eine ganze Reihe epidemiologischer Studien zur Effektivität des PSA-Screenings, doch konnte ein Wirksamkeitsnachweis bisher nicht erbracht werden. Zwei große randomisierte Studien in Europa und den USA lassen für die Jahre 2005–08 erste Ergebnisse erwarten. Da epidemiologische Arbeiten belegen, dass durch PSA-Screening eine nicht unerhebliche Überdiagnostik und Übertherapie eintritt, d. h. Schaden angerichtet werden kann, ist das Ergebnis der genannten randomisierten Studien vor weitergehenden Entscheidungen unbedingt abzuwarten. Bis dahin sollte von der Anwendung des PSA-Tests zur Prostatakrebsfrüherkennung unmissverständlich abgeraten werden. Da für den Test bereits ausgiebig Werbung betrieben wurde, kommt einer gründlichen ärztlichen Aufklärung von an dem Test interessierten Personen eine Schlüsselrolle zu.     

Cancer immunotherapy

Unprecedented progress has seen made in the last decade in the field of cancer immunotherapy. The recent approval of nivolumab （Opdivo）, the first anti-programmed cell death-1 （PD-1） antibody, for metastatic melanoma in Japan, marked a milestone in the rapidly advancing field of cancer immunotherapy. Nivolumab together with ipilimumab （Yervoy）, the anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 （CTLA-4） antibody, are the first 2 drugs in the class of ＂immune checkpoint inhibitors＂ that have delivered impressive responses in patients with metastatic melanoma and renal cell cancer （RCC） as well as a variety of solid tumors.     

异基因造血干细胞移植后患者肝损害病因与临床特征分析

 【摘要】　目的　总结异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后患者肝损害的发生率、发生原因、诊断方法与治疗选择。方法　回顾性分析郑州大学附属肿瘤医院2006～2010年接受allo-HSCT的83例良、恶性血液病患者中Ⅱ～Ⅳ级肝损害的发生率、各种病因的构成比、临床表现以及诊断方法,分析移植后不同时期肝损害病因的差异、治疗方法、疗效。结果　83例allo-HSCT患者中,发生Ⅱ～Ⅳ级肝损害45例（54.2 %）。按肝损害致病病因分类,预处理化疗所致7例,环孢素所致9例,肝静脉闭塞病（HVOD）所致2例,肝脏移植物抗宿主病（GVHD）所致24例,乙型肝炎病毒再激活所致2例,多器官衰竭所致1例。发生于移植后1个月内者20例（44.4 %）,以药物性肝损害为主,1个月～100 d者13例（28.9 %）,101 d～1年者12例（26.7 %）,均以肝脏GVHD为主。经减停肝损害药物、抗排异、保肝等治疗后,27例治愈,10例好转,2例未愈,6例死于原发病复发或移植相关并发症。结论　肝损害是allo-HSCT后常见的并发症,药物及肝脏GVHD是其最主要的致病原因,肝损害与其发生时间的相关性可作为肝损害病因学诊断的参考依据。根据肝损害的病因选择针对性的治疗方法,可取得较好的疗效。     

Pharmacokinetics and dosage of fluconazole in continuous hemofiltration (CAVH, CVVH) and hemodialysis (CAVHD, CVVHD)

Continuous haemofiltration (CAVH, CVVH) and haemodialysis (CAVHD, CVVHD) are increasingly used in patients with acute renal failure (ARF). The elimination rates of fluconazole vary considerably among the different procedures. In CVVHD, the elimination rate is, depending on the combined dialysate/ultrafiltrate flow rate, the most marked compared to CVVH and intermittent dialysis with a fluconazole clearance exceeding the values of healthy persons in CVVHD 2 L/h. To achieve therapeutic plasma levels during continuous renal replacement therapy, the same loading dose as in patients without renal failure should be applied, followed by the adjusted maintenance dose for anuric patients multiplied by a factor taking the extracorporeal elimination of the absorbed dose into account (CAVH, CVVH: x 2.2, ultrafiltrate flow 0.5 L/h; CAVHD, CVVHD: x 3.8, combined dialysate/ultrafiltrate flow 1.5 L/h). Despite the broad therapeutic margin of fluconazole, drug monitoring is recommended with respect to the very limited number of investigations with relatively low dosages up to 200 mg/day and--which is of paramount importance--to achieve therapeutic drug levels in vital indications.