循环抗原及血清抗体的联合检测诊断日本血吸虫病

目的探讨日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)在血吸虫病免疫诊断中的价值。方法制备并纯化抗重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的单抗和多抗,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA);以纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA,分别比较该两种方法以及两种方法联合检测对于急、慢性血吸虫病患者免疫诊断的特异性和敏感性。结果利用双抗体夹心ELISA、间接ELISA和联合检测3种方法检测急性患者血清70例,敏感性分别为72.9%、75.7%和91.4%;检测慢性患者血清110例,敏感性分别为46.4%、61.8%和82.7%;检测正常人血清100例,特异性分别为96%、92%和92%;吡喹酮治疗后患者血清161份,其中急性治疗后1年以内转阴率分别为50%、38.9%和33.3%;慢性治疗后1年内分别是76.4%、55.6%和43.1%;慢性治疗后2年以上分别为93.0%、83.0%和78.9%。3种方法检测华支睾吸虫病、钩虫病的交叉反应性分别为0%、15.6%和15.6%,8.7%、19.6%和21.7%。3种方法的敏感性、与华支睾吸虫感染者血清交叉反应、慢性治疗1年内及慢性治疗2年以上患者血清的转阴率差异具有显著性(P<0.05),而特异性、与钩虫感染者血清交叉反应及其他化疗后患者血清的转阴率差异无显著性(P>0.05)。结论循环抗原Sj14-3-3和抗体联合检测在日本血吸虫病免疫诊断中具有潜在的临床应用价值。     

单克隆抗体夹心ELISA定量检测日本血吸虫循环抗原

目的反映日本血吸虫病活动性感染程度,探讨建立定量测定循环抗原的方法。方法筛选和制备单克隆抗体,将其进行优化组合,建立双抗体夹心ELISA,计算标准曲线,测试检测能力,检测样本。结果获6个抗日本血吸虫单克隆抗体,经优化组合试验,选择其中3个抗日本血吸虫虫卵TCA可溶性抗原和成虫TCA可溶性抗原进行搭配,用于检测日本血吸虫病患者血清中循环抗原效果较理想。检测慢性血吸虫病118例,阳性61例,阳性率51．7％;急性患者30例,全部阳性;正常人187例,5例阳性,特异性97．3％。单盲法检测一批血清,结果也较满意。法论定量检测日本血吸虫病患者血清中循环抗原,对提示活动性感染的程度和疫苗保护作用的评估具有一定的应用价值。     

日本血吸虫尾蚴抗原模拟表位的筛选及其免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，探讨其对日本血吸虫的免疫保护性。方法 用粗提日本血吸虫尾蚴抗原的抗体IgC作配体筛选噬菌体12肽库，按“吸附－洗脱－扩增”的过程进行三轮筛选；随机挑取单个噬菌体克隆进行Dot-ELISA检测；用混和噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染45d后剖杀冲虫，计算虫数及肝卵数。结果 经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，挑取11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定，均与日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清呈特异性反应。与对照组相比，混和噬体克隆免疫小鼠的减虫率为18.79%，减卵率为38.00%。结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，这些表位能诱导对日本血吸虫的保护性免疫。     

Modification and identification of a vector for making a large phage antibody library

Background The large phage antibody library is used to obtain high-affinity human antibody, and the Loxp/cre site-specific recombination system is a potential method for constructing a large phage antibody library. In the present study, a phage antibody library vector pDF was reconstructed to construct diabody more quickly and conveniently without injury to homologous recombination and the expression function of the vector and thus to integrate construction of the large phage antibody library with the preparation of diabodies. Methods scFv was obtained by overlap polymerase chain reaction (PCR) amplification with the newly designed VL and VH extension primers. loxp511 was flanked by VL and VH and the endonuclease ACC Ⅲ encoding sequences were introduced on both sides of loxp511. scFv was cloned into the vector pDF to obtain the vector pDscFv. The vector expression function was identified and the feasibility of diabody preparation was evaluated. A large phage antibody library was constructed in pDscFv. Several antigens were used to screen the antibody library and the quality of the antibody library was evaluated. Results The phage antibody library expression vector pDscFv was successfully constructed and confirmed to express functional scFv. The large phage antibody library constructed using this vector was of high diversity. Screening of the library on 6 antigens confirmed the generation of specific antibodies to these antigens. Two antibodies were subjected to enzymatic digestion and were prepared into diabody with functional expression. Conclusions The reconstructed vector pDscFv retains its recombination capability and expression function and can be used to construct large phage antibody libraries. It can be used as a convenient and quick method for preparing diabodies after simple enzymatic digestion, which facilitates clinical trials and application of antibody therapy.     

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的 从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法 以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过“吸附-洗脱-扩增”对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果 以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11 ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论 通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。     

引导选择抗细胞表面分子单链抗体

目的用引导选择方法从抗KGla细胞的噬菌体展示抗体库中分离单链抗体.方法首先用KGla细胞吸附法富集抗体库3轮或未富集,再分别用抗CD34单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用免疫荧光和流式细胞术鉴别其细胞结合特异性.酶联免疫吸附法分析部分克隆与CD34抗原的结合,并对10个阳性克隆进行DNA序列分析.用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹,鉴别其抗原分子量.结果从144个经3轮富集和引导选择的单菌落中挑选出100个阳性单克隆,从96个未经富集的文库中引导选择出2个阳性克隆.102个阳性克隆中47个可识别KGla、HL60、U937、和CEM细胞(KGla 、HL60 、U937 、CEM ),55个只识别KGla细胞(KGla 、HL60-、U937-、CEM-).其中28个只识别KGla细胞的单克隆经ELISA检测均不结合CD34抗原.10个阳性克隆的DNA序列分析显示来自4种不同克隆,所结合的抗原显示不同的分子量.结论从抗KGla单链抗体库分出102个能识别造血干细胞和祖细胞的阳性克隆,引导选择在改进筛选效率方面具有优越性.     

日本血吸虫抗原的表位模拟肽筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雄虫抗原的表位模拟肽 ,并探讨其诱导小鼠抗日本血吸虫的免疫保护性。　方法　用日本血吸虫可溶性雄虫抗原的IgG对噬菌体随机 1 2肽库进行亲和筛选。 3轮筛选后 ,经Dot-ELISA检测获得阳性噬菌体克隆 ,并用混合特异性噬菌体克隆免疫小鼠及进行抗日本血吸虫免疫保护性分析。　结果　 1 8个特异性噬菌体克隆均显示有抗原性 ,其噬菌体混合克隆免疫诱导小鼠产生了特异性抗体 ,以及 31 72 %的减虫率和 51 54%的减卵率 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 0 1 )。　结论　筛选噬菌体肽库获得的日本血吸虫可溶性雄虫抗原的表位模拟肽分子能诱导小鼠产生抗日本血吸虫的保护性免疫。     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

改良单克隆抗体Dot—ELISA检测血吸虫循环抗原

用抗趋阴极循环抗原单克隆抗体建立的Dot-ELISA检测血吸虫循环抗原显示有高度的敏感性和特异性,极少交叉反应。68份急性血吸虫病患者血清的阳性检出率为98.5%,216份慢性血吸虫病血清的阳性检出率为83.3%。225份正常人血清仅1份阳性。48例血吸虫病治愈者的阴转率为97.9%。实验性血吸虫病家兔治疗后8周,16只治愈的家兔中12只阴转。     

Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography

Objective To isolate human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by a new method of panning phage antibody library based on immobilized metal affinity chromatography （1MAC）. Methods Phage antibody library was allowed to mix with hex-His tagged expressed HEV specific antigen, NE2, in solution for adequate binding before affinity resin for hex-His was added. The non-specific phage antibodies were removed by extensive washing and the specific bound phage antibodies could then be eluted to infect TG1 or repeat the binding process for subsequent rounds of purification. The specificity of the selected human antibodies were tested by antigen competitive ELISA, human sera blocking ELISA, scFv expression, and sequence analysis. Results His-NE2 specific recombinant phages were successfully enriched after panning procedure. Two individual phage clones, 126 and 138, showed 50% inhibition in NE2 antigen competition ELISA and obvious blocking effect by HEV positive serum in blocking ELISA. Soluble scFv of 126, 138 bound to NE2 specifically. Conclusion Two specific human phage antibodies against hepatitis E virus （HEV） from phage display library were isolated by immobilized metal affinity chromatography. The immobilized metal affinity chromatography applied to phage antibody selection was a helpful supplement to the selection in solution.     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库的初步报告

东方田鼠 (Microtusfortis,Mf)对日本血吸虫 ( Schistosomajaponicum ,Sj)感染具有抗性。为探讨Mf感染Sj后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答 ,作者用Mf受感染血清对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,经初筛和复筛 ,共筛选出 1 2个阳性克隆 ,这些阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切后PCR扩增显示 ,插入的SjcDNA片段大小在30 0bp～ 1 .8kb之间 ,其中 30 0bp片段 6个 ,1kb片段 1个 ,1 8kb片段 5个。说明Mf感染血清可识别Sj的特异性抗原分子。后者的免疫保护作用值得进一步研究     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫成cDNA文库的初步 …

东方田鼠（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｆｏｒｔｉｓ,ＭＤ）对日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐａｎｉｃｕｍ,Ｓｊ）感染具有抗性。为探讨Ｍｆ感染Ｓｊ后是否产生针对虫体某些抗原分子的免疫应答,作者用Ｍｆ受感染血清对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行免疫筛选,经初向下和复筛,共筛选出１２个阳性克隆,这些阳笥克隆经辅助噬菌体自动剪切后ＰＣ扩增显示,插入的Ｓｊ ｃＤＭＡ片较大小在３００ｂｐ～１．８ｋｂ之间,其中３００ｂ     

人-人嵌合抗丙肝抗体检测阳性对照品的研制及应用

目的:获得人-人嵌合型抗丙肝抗体的阳性对照品。方法:采集20例具有高抗体滴度的抗丙肝抗体阳性患者外周血,混合后分离外周血单个核细胞,TRIzol提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR分别扩增重链可变区和轻链可变区并以其为模板,获得ScFv,导入到PCANTAB 5E载体上构建噬菌体展示库。分别用NS3、NS4、NS5和core抗原对噬菌体库进行5轮的富集和淘洗;通过Phage ELISA的方法对单克隆菌落进行特异性鉴定,分别获得抗丙肝NS3、NS4、NS5抗体和两个抗丙肝core抗体。将ScFv的VH和VL分别克隆到pcDNA3.4载体上,构建人IgG全长抗体并通过Lipo3000转染293T细胞。收集细胞上清,经protein A纯化,保存于-80℃。结果:成功构建了抗丙肝抗体噬菌体库;筛选并表达了5个分别针对NS3、NS4、NS5和core抗原的阳性抗体,经验证表达的抗丙肝阳性抗体在-20°C~37°C表现稳定。多次重复冻融后不会影响抗体的使用效果。且5种抗体在国内外多种丙型肝炎检测试剂盒间测试均为阳性,具备一定的通用性。结论:获得5种人-人嵌合型抗丙肝抗体的阳性对照品且适用于多种丙型肝炎检测试剂盒。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的：寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子，为血吸虫病疫苗研究提供新的侯选抗原。方法：用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，Ｓｊ）成虫ｃＤＮＡ文库，并对阳性克隆的插入基因片段进行ＰＣＲ扩增及测序分析。结果：经三轮筛选，获１０个阳性克隆，其插入的Ｓｊ ｃＤＮＡ片段大小为１．５～１．８ｋｂ。初步测序获５个部分序列，其中２个序列分别与Ｓｊ动力蛋白     

噬菌体随机肽库筛选日本血吸虫22.6kDa蛋白有效抗原表位的初步研究

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选出中国大陆株日本血吸虫22.6kDa蛋白（Sj22.6kDa抗原表达的短肽分子，探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。方法：以纯化的抗日本血吸虫22.6kDa的多克隆抗体IgG为配基，对噬菌体12肽库进行5轮亲和筛选，富集特异性噬菌体，挑取克隆，经序列分析，免疫识别和动物初筛后获得阳性克隆。结果：经过5轮筛选，特异性噬菌体得到有效富集。随机挑选的24个噬菌体克隆中获得4个有效抗原表位。结论：利用噬菌体随机肽库筛选可获得类似日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导抗血肿虫的保护性免疫。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶在虫卵阶段的定位

目的探讨谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)在虫卵阶段的表达、定位和重组蛋白(rSj26GST)的免疫诊断价值。方法从感染日本血吸虫尾蚴6周的兔肝脏中分离虫卵,分别用RT-PCR和免疫印迹(Western blotting)法检测Sj26GST基因在虫卵阶段的转录和翻译;同时用兔肝做免疫组化观察Sj26GST在虫卵内的分布。利用纯化的rSj26GST和日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),采用间接ELISA法检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从血吸虫虫卵中扩增670bp的基因片断,Western blotting证明在虫卵阶段Sj26GST的表达;同时免疫组化显示Sj26GST主要分布在虫卵内毛蚴两边的侧腺。rSj26GST检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清的阳性率分别为92%、80%和0;用SEA检测以上标本,阳性率分别为96%、84%和2%。结论Sj26GST是SEA的主要组分之一,能刺激机体产生高滴度的抗体;rSj26GST为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性,具有实用价值。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv

目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。     

噬菌体7肽库中筛选细粒棘球蚴头节抗原的模拟表位的初步研究

目的：从噬菌体7肽库中寻找细粒棘球头节抗原的模拟表位。方法：以细粒棘球蚴头节抗原的单克隆抗体作靶分子筛选噬菌体7肽库，经过第3轮筛选后进行ELISA检测及竞争抑制试验后，挑取9株阳性克隆进行序列测定，序列比较后得到保守序列。结果：经过第3轮亲和筛选，阳性克隆得到富集。ELISA检测和竞争抑制试验证明，该小肽具有良好的免疫活性和特异性。结论：肽片段可能是细粒棘球蚴头节抗原的抗原表位，可作为包虫病疫苗的备选免疫原。