丙型肝炎病毒核心蛋白在鼠肝中表达的诱癌作用

目的:研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)在鼠肝中的表达和可能潜在的直接致癌作用. 方法: 以病毒重组技术制备含HCV Core区cDNA的重组腺伴随病毒载体. 重组腺伴随病毒感染大鼠肝脏,感染2, 9 mo后分别以Southern blot印迹杂交法和Dot blot杂交法检测鼠肝HCV Core区基因的整合、mRNA形成情况及病毒滴度. HE染色观察诱癌实验结果. 结果: 收获重组病毒滴度为2.41×1014颗粒数(分子数)/L. 分别感染2, 9 mo后检测大鼠肝脏Southern blot印迹杂交结果和HCV core mRNA均为阳性,HCV core基因为非定点整合. 感染后9 mo实验组大鼠部分细胞有恶性倾向.结论:HCV core在大鼠肝中持续表达,初步观察到其致瘤变作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白的研究进展

肝细胞癌(HCC)自上世纪90年代已成为我国仅次于肺癌位列第二位的癌症杀手,而丙型肝炎病毒(HCV)携带的慢性感染则成为产生HC的主要危险因素之一。统计发现,高达80%的急性HCV患者会最终转化为慢性肝炎,进而恶变成肝硬化,致肝癌的几率明显上升。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属,由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋白和6个非结构蛋白,其中3个结构蛋白为HCV核心蛋白。有大量研究证实,核心蛋白潜在癌基因是HVV形成的重要促进因素。由于癌基因变异积     

丙型肝炎病毒核心抗原在肝细胞癌及癌旁组织中的表达

应用ＳＰ法（链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连结法）对肝细胞癌（４６例）癌组织及癌旁组织（３８例）中丙型肝炎病毒核心抗原进行免疫组织化学染色，发现两者的检出率分别为２１．７％和３６．８％。阳性染色细胞呈弥漫、灶状和散在分布。抗原定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆内，少数有围核分布的特点。阳性染色多呈细颗粒状，少数呈均质状。癌旁组织抗原表达区域中有淋巴细胞浸润聚集。结果提示丙型肝炎病毒感染在肝细胞癌的发生中可能有一定的关联。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术,扩增出357 bp的HCV核心蛋白基因片段,双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a/HCVc。转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况,Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达;SDS-PAGE电泳显示其在32 000处有一条融和表达条带;Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因序列变异分析

为了研究西安地区丙型肝炎病毒基因组中Ｃ区基因的变异性,采用单链构象多态性（ｓｉｎｇｌｅ－ＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）分析方法,对３６份ＨＣＶＲＮＡ阳性血清的ＰＣＲ产物进行分析,结果有３１份样品的ＳＳＣＰ图谱同,对其中二份样品进行测序,证明序是相同的;     

丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系

目的　探讨丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝(癌 )细胞凋亡的关系及其意义 .方法　采用免疫组织化学方法检测 HCV核心区抗原和 NS3区抗原在肝硬变 (L C)和肝细胞肝癌 (HCC)组织中的分布 ,同时对连续切片进行原位凋亡检测并计算凋亡指数 .结果　 HCV核心区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质或胞核中 ,在 L C组织中 ,核心抗原呈弥漫或灶状分布于肝细胞胞质 ,偶见胞核阳性的肝细胞 ,阳性率为 6 0 .7% ;核心抗原在癌组织中以核阳性分布为主 ,阳性率为 37.6 % ,癌旁肝组织以胞质阳性为多见 .HCC中 HCV核心抗原的核阳性率 (75 .0 % ,15例 / 2 0例 )明显高于其在 L C(17.7% ,6例 / 34例 )及癌旁肝组织 (11.8% ,2例 / 17例 )中的阳性率 (P<0 .0 5 ) ;在 HCC中 ,HCV核心抗原核转位表达的癌组织的 AI值 (0 .174± 0 .0 93)显著低于胞质阳性的癌组织 (0 .5 12± 0 .113,P<0 .0 1) . HCV NS3区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质中 ,在 L C和 HCC组织中的阳性率分别为 5 3.6 %和 39.6 % .未发现 HCV NS3区抗原的表达与肝(癌 )细胞凋亡的相关性 .结论　 HCV感染与我国 L C,HCC的发生关系密切 ,HCV核心抗原在肝癌组织中常发生核转位表达 ,这种核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡 ,从而促进肿瘤组织的进一步恶化     

不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达. 方法:用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段,对应氨基酸分别为C573:1-191aa,C510:1-59aa 81-191aa,C507:1-169aa,C444:1-59aa 81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSET-A中构成重组质粒(pRSET-A-C573,pRSET-A-C510,pRSET-A-C507,pRSET-A-C444),转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定. 结果:经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDS-PAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论:全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白生物学功能研究进展

目的：概述丙型肝炎病毒核心蛋白的主要生物学功能。方法：查阅并参考国外近年20多篇相关献资料。结果：综述了丙型肝炎病毒核心蛋白T、B细胞表位及对细胞周期的影响。结论：核心蛋白是丙型肝炎病毒疫苗研究的靶区域,与病毒持续性感染、肝细胞肝癌的发生密切相关,对其深入研究有助于探讨丙型肝炎病毒的致病机制及其防治。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用

目的研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。方法构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用。利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用。结果加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80%,与空白对照比较有显著性差异(P<0.05)。在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加。该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系。在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)。结论核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性。核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与转位蛋白相互作用的研究

目的 本文为了探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)在肝肿瘤中起作用的分子机制,研究核心蛋白是否与肿瘤相关蛋白的相互作用。方法 应用酵母双杂交系统3构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆,对既能在四缺营养缺陷培养基上生长（SD／-Trp-Leu-His-Ade),又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析。发现一个可以引起染色体转位的基因即与肿瘤发生有关的基因转位蛋白基因（Translin)同源。为了进一步证实转位蛋白基因所表达蛋白能与HCV核心蛋白相互作用,网织红细胞裂解物进行体外翻译、蛋白之间的免疫共沉淀。结果 结果显示,转位蛋白不但在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,而且在体外翻译后也能相互作用。结论 HCV核心蛋白可以和转位蛋白相互作用,推测此蛋白可能在HCV致癌中起一定作用,部分解释了HCV引起肿瘤的发病机制。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白在肝癌发生中的作用

丙型肝炎病毒(HCV)是一种RNA病毒，属黄病毒科。于1989年克隆成功，HCV基因序列清楚。长约9400个核苷酸，由5’端非编码区(NCR)、单一开放阅读框(ORF)、3’端非编码区(NCR)组成。5’端具有高度保守性，在病毒复制及保持病毒性状方面起重要作用，3’端在病毒复制过程中起一定作用。ORF长约9030nt，编码3010个氨基酸，称为病毒多蛋白前体。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Dicer切割功能的影响

目的 探讨核心蛋白与Dicer的相互作用及其对Dicer功能的影响.方法 构建丙型肝炎病毒核心蛋白真核表达质粒,采用免疫荧光染色和Western blot检测核心蛋白的表达,Western blot检测核心蛋白对细胞内Dicer表达的影响,免疫共沉淀技术检测真核细胞内核心蛋白与Dicer的相互作用.体外转录合成dsRNA,检测核心蛋白对Dicer切割dsRNA作用的影响.结果 在细胞内,核心蛋白能够明显恢复被shRNA抑制的虫荧光素酶基因的表达(P＜0.05),而对siRNA引发的RNAi无拮抗作用.在真核细胞内,加入核心蛋白后,Dicer的表达量无明显改变,并能检测到两者相互结合.在体外抑制实验中,重组表达的Dicer能切割dsRNA产生siRNA;核心蛋白加入后,dsRNA的切割受到抑制.结论 核心蛋白在真核细胞内可以结合Dicer,并通过抑制Dicer对dsRNA的切割作用,抑制RNA干扰作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制肝癌细胞P16、P27的表达

目的：探讨HCV核心蛋白对肝瘤细胞P16、P27表达的影响。方法：将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK－CMV的Hind　Ⅲ和BamH I位点间，构建重组质粒PBK－HCVc。再将重组质粒PBK－HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组化，蛋白印迹检测P16、P27蛋白表达；RT－PCR检测P16、P27mRNA。结果：重组质粒PBK－HCVc在HepG2细胞中有稳定表达；表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的P16、P27在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显下降。结论：HCV核心蛋白能抑制P16、P27表达，可能与肝细胞的癌变有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用

目的:探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用。方法:将表达HCV核心蛋白的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-core转染人源肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株QSG7701-core,利用免疫细胞化学、Western blot及凝胶电泳迁移实验（EMSA）等方法检测stat3的磷酸化及DNA结合活性。结果:在表达HCV核心蛋白的QSG7701细胞中,stat3的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组,而总stat3的表达水平3组无明显差别;核内磷酸化的stat3阳性信号明显减弱; stat3的DNA的结合活性明显低于空白质粒转染组和未转染组。结论:在人源永生化肝细胞系中HCV核心蛋白的表达可能具有抑制stat3的磷酸化和DNA结合活性的作用,从而抑制JAK/ stat3信号转导通路活化,这可能是HCV干扰素治疗效果不佳的原因之一。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与JNK／SAPK信号转导通路

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是一种多功能的病毒核衣壳蛋白,对细胞信号转导途径具有明显作用,从而影响相关的靶基因。JNK／SAPK信号转导通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用,是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。