瘢痕成纤维细胞的MMP-3 mRNA表达及其基因转染

目的：探讨增生性瘢痕组织中细胞外间质（ＥＣＭ）的过度沉积机制，并探索其基因治疗途径。方法：体外培养瘢痕成纤维细胞（ＨＳＦ），构建间质溶解素１（ＭＭＰ－３）逆转录病毒载体，利用基因转染技术将ＭＭＰ－３基因转入ＨＳＦ，核酸分子杂交检测ＭＭＰ－３的ｍＲＮＡ表达水平。ＤＮＰ－多肽降解法检测间质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）活性，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照。结果：ＨＳＦ表达ＭＭＰ－３ｍＲＮＡ水平及降解ＤＮＰ－多肽     

雷帕霉素对mTOR基因诱导的NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的探讨雷帕霉素对mTOR基因诱导的NI H3T3成纤维细胞增殖的影响。方法以mTOR基因转染小鼠NI H3T3成纤维细胞,以雷帕霉素干预,用MTT法检测细胞增殖情况,用RT-PCR和Western blot方法测定细胞p70S6KmRNA与蛋白的表达。结果 MTT法检测转染mTOR基因后细胞增殖能力增强,雷帕霉素可抑制其增殖;RT-PCR与Western blot检测转染后细胞p70S6K的mRNA与蛋白表达水平明显增加,雷帕霉素可抑制p70S6KmRNA与蛋白表达水平。结论雷帕霉素可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路抑制成纤维细胞增殖。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞的免疫细胞化学研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)转染体外培养的人表皮细胞后细胞表型的变化. 方法:通过脂质体(Lipofectamine TM2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,36h后采用免疫细胞化学染色法检测分析β1整联蛋白、CK19、CK14及CK10在表皮细胞中表达的变化,同时以pEGFP-C3质粒转染的表皮细胞作为对照. 结果:实验组细胞中CK19、CK14的表达增强, 而CK10作为终末分化细胞的标志表达减弱. 结论:pEGFP-C3-bFGF转染后,分化成熟的表皮细胞向幼稚型细胞方向发生去分化,为探讨 bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

乙醇对NIH 3T3成纤维细胞成脂分化的影响

目的观察乙醇对NIH 3T3成纤维细胞分化为脂肪细胞的作用,及其对成脂转录因子PPARγ表达的影响.方法以不同浓度乙醇作为诱导剂处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,苏丹Ⅳ染色,采用电子计算机图像分析软件Image Pro Plus 4.1,确定脂肪细胞百分比.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,检测细胞PPARγ mRNA的表达.结果以递增浓度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)乙醇处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,在0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L乙醇组中,脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.001).0.03 mol/L乙醇组与对照组间的脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论乙醇能够直接诱导NIH 3T3成纤维细胞大量分化为脂肪细胞,这可能是乙醇性骨坏死时骨髓内脂肪增多的原因之一.     

人釉原蛋白基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

[目的]分析釉原蛋白基因转染对牙龈成纤维细胞生物学活性的影响,为其进一步应用于基因增强牙周组织工程奠定实验基础.[方法]脂质体转染法将人釉原蛋白基因转入人牙龈成纤维细胞内,Zeoin筛选获得阳性克隆.以ELISA法检测重组釉原蛋白在转染细胞内以及培养上清液中的表达;进一步以MTT比色法分析基因转染对细胞增殖和分化的影响.[结果]釉原蛋白基因转染后,人牙龈成纤维细胞可以在胞内合成重组人釉原蛋白并将其分泌至胞外,表达浓度分别为0.277μg/mL和0.147μg/mL;与未转染组相比,釉原蛋白基因转染可显著促进牙龈成纤维细胞增殖(P＜0.05),并且差异随时间增大.转染后的牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性也较对照组有显著提高(P＜0.05).[结论]外源性釉原蛋白基因能够在人牙龈成纤维细胞获得表达,并显著促进其增殖以及向成骨细胞方向转化,可以应用于基因增强牙周组织工程.     

超声联合超声造影剂对VEGF基因体外转染成纤维细胞转染率的影响

目的：观察诊断剂量超声联合超声造影剂对血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因转染体外培养成纤维细胞转染率的影响。方法：将成纤维细胞分为单纯VEGF₁₆₅质粒转染组、造影剂+VEGF₁₆₅质粒转染组、超声+VEGF₁₆₅质粒转染组［机械指数(MI)为1.6］和超声+造影剂+VEGF₁₆₅质粒转染组（MI分别为 1.2、1.4和1.6）。转染后在激光共聚焦显微镜下观察各组VEGF在成纤维细胞中的转染率。结果：超声+VEGF₁₆₅质粒组、造影剂+VEGF₁₆₅质粒组与单纯VEGF₁₆₅质粒组转染率比较差异无显著性（P>0.05）;超声+造影剂+ VEGF₁₆₅质粒组（MI 1.2、1.4、1.6）转染率增加,与单纯VEGF₁₆₅质粒组转染率比较差异均有显著性（P<0.01）;其中超声+造影剂+VEGF₁₆₅质粒组（MI 1.4、1.6）转染率最高,但2组间比较差异无显著性（P>0.05）;超声+造影剂+ VEGF₁₆₅质粒组（MI 1.4、1.6）与超声+造影剂+ VEGF₁₆₅质粒组（MI 1.2）比较差异也有显著性（P<0.05）。结论:联合超声造影剂诊断剂量
的超声照射能提高VEGF基因的转染率,且随超声剂量增加转染率升高.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对虹膜色素上皮细胞增殖及细胞周期的影响

目的:了解重组腺相关病毒(rAAV)载体介导碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对体外培养的虹膜色素上皮细胞(IPE)增殖及细胞周期的影响.方法:在体外培养的IPE细胞中加入转染rAAV-bFGF基因细胞和未转染细胞的培养液上清,继续培养4 h或1 d后分别应用MTT法和流式细胞仪检测IPE细胞的生长状况.结果:MTT法结果显示,加入rAAV-bFGF基因转染组培养液上清的IPE细胞D值为0.338±0.047,对照组为0.277±0.064,2组相比,t=3.745,P<0.05.流式细胞仪检测结果显示:加入rAAV-bFGF基因转染组培养液上清的S期IPE细胞为(21.19±1.93)%,与对照组(16.47±2.37)%相比.t=-3.448,P<0.05.结论:转染rAAV-bFGF的IPE细胞分泌的bFGF具有生物活性,这为rAAV-bFGF转染IPE细胞移植治疗视网膜色素变性提供了理论支持.     

hPDGF-B基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

目的：检测hPDGF-B基因转染对Beagle犬牙龈成纤维细胞生物学活性的影响。方法使用脂质体LipofectamineTM2000将携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03转染至Beagle犬牙龈成纤维细胞,观察转染后细胞的形态以及增殖的变化;流式细胞仪检测转染细胞的周期以及凋亡情况;Real-timePCR法检测转染后细胞表达CollagenI、CollagenXII、α-SMA的变化。结果转染后的牙龈成纤维细胞形态多样,但增殖显著;转染组S期细胞比率增高,转染细胞未出现凋亡;转染后细胞上调CollagenI基因的表达,下调CollagenXII和α-SMA的表达。结论hPDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞后,产生PDGF-BB-eGFP融合蛋白,融合蛋白可能通过自分泌和旁分泌的方式作用于牙龈成纤维细胞,从而促进细胞增殖。hPDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞后,细胞并不能出现逆向分化,细胞对外周基质的改建能力下降,但细胞合成胶原的能力显著增强。     

bFGF基因转染的牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合物的体外构建

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因修饰的牙龈成纤维细胞（GFs）与组织工程支架材料脱细胞真皮基质（ADM）复合后的生长、结合情况,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗提供依据。方法将转染bFGF的GFs接种于ADM真皮面,通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、透射电镜及组织学检查,观察细胞的生长状况及其与支架材料的复合情况。结果基因修饰的牙龈成纤维细胞复合ADM膜后生长良好,24 h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞在支架材料中生长,并与支架材料结合紧密。结论转染bFGF基因的的GFs与ADM膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

转染人转化生长因子-β3基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 观察转染人转化生长因子-β3(hTGF-β3)基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法 通过脂质体介导的方法，将人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒(pBK-CMV)-TGF-β3质粒转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，采用RT—PCR法检测TGF-β3mRNA的表达，放射免疫(RIA)法测定细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的浓度。结果 构建的TGF-β3质粒可成功转染成纤维细胞，并增强Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，下调Ⅰ／Ⅲ型胶原比值。结论 转染hTGF-β3基因可调节瘢痕成纤维细胞的生物学活性。     

连续应力对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响

目的模拟临床治疗中机械应力对细胞的作用方式,研究连续应力作用于成纤维细胞的生长增殖效应。方法实验采用细胞机械牵拉培养模型和体外培养的3~5代的成纤维细胞,分为对照组(未牵拉组)、连续牵拉组和重复连续牵拉组,各组分别进行牵拉后细胞计数和MTT比色法检测。结果连续牵拉组的细胞数量和活性较对照组明显增加,重复连续牵拉组的细胞数量和活性较连续牵拉组明显增加。结论连续应力可以促进体外培养成纤维细胞生长增殖和活性增加。     

BMP-2基因转染人成纤维细胞株KMB-17量效关系的研究

目的：确定BMP-2基因转染入成纤维细胞株KMB-17的实验中质粒DNA和脂质体（lipofectin)最佳使用剂量，以获得BMP-2基因转染KMB-17细胞的最佳条件。方法：采用不同剂量整合有BMP-2基因的质粒DNApBK-B2和lipofectin转染KMB-17细胞，通过免疫组化染色阳性细胞计数和MTT法检测细胞增殖的方法，确定不同剂量pBK-B2质粒DNA和lipofectin对细胞转染效率和增殖的影响。结果：当lipo-fectin用量为5μL，pBK-B2质粒DNA为2μg时，BMP-2基因在KMB-17细胞内表达比例最高，且对细胞增殖无明显影响。结论：采用合适剂量的质粒DNA和脂质体转染BMP-2基因，可以使大多数KMB-17细胞被转染并且不会影响细胞增殖。     

节律蛋白mPERl在NIH3T3细胞增殖和迁移中的作用

目的 研究PERl蛋白对NIH3T3细胞增殖和迁移的影响。方法 将重组表达质粒pcDNA3．1／mPERl转染入NIH3T3细胞中．并以未转染的NIH3T3细胞为对照．利用MTT法检测细胞增殖的改变。利用RT-PCR技术和Westernblot检测节律蛋白mPERI对细胞迁移关键性蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达的影响。结果 MITT法显示PERl表达上调可以抑制NIH3T3细胞增殖．RT—PCR技术和Westernblot检测显示在NIH3T3细胞中。当节律蛋白roPERl表达上调时，细胞迁移关键性蛋白MMP-2在RNA和蛋白水平的表达较对照组降低。结论 上调NIH3T3细胞内的PERl蛋白表达能抑制细胞增殖以及细胞迁移的关键性MMP-2在RNA和蛋白水平的表达。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

MnSOD基因转染对SGC79001胃癌细胞增殖的影响

目的观察改变胞内MnSOD基因表达水平对SGC7901胃癌细胞增殖的影响。方法采用电穿孔方法将反义和正义MnSOD cDNA真核表达载体pHβA-SOD(-)／pHβA-SOD( )转染SGC7901胃癌细胞，400mg／LG418筛选稳定表达克隆并用RT-PCR及Western杂交法鉴定后扩大培养。用pHβA空质粒转染作为对照。放射免疫法检测正义、反义及空载SGC7901胃癌细胞株内的铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD，SOD1)蛋白含量。分别用直接细胞计数法、四唑蓝(MTT)比色法、平皿克隆形成率试验及裸鼠移植瘤模型测定3组细胞在体外、体内的增殖活性。结果与空载组(Vector-7901)相比，转染正义质粒的MnSOD-7901胃癌细胞呈现抑增殖效应：(1)生长曲线示增殖速度减慢；(2)在平皿上的集落形成能力下降；(3)在裸鼠体内的成瘤性明显受抑制。转染反义质粒的MnSOD-AS7901胃癌细胞则出现促增殖效应：(1)生长曲线示增殖速度加快；(2)在平皿上的集落形成率上升；(3)裸鼠移植瘤生长加速。结论通过基因转染提高胞内MnSOD的表达可抑制胃癌细胞的增殖，MnSOD可能是胃癌基因治疗的一个新靶点。     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

p21/WAF1基因对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察p21／WAF1基因对体外培养的人视网膜色素上皮(hRFE)细胞增殖的影响。方法hRFE细胞原代、传代体外培养，通过脂质体介导将p21／WAF1基因转人体外培养的hRPE细胞。免疫组织化学法检测p21蛋白表达水平，并用MTT法检测其对hRFE细胞增殖抑制的作用，同时利用流式细胞仪来分析p21／WAF1基因对细胞周期的影响。结果 MTT法显示p21／WAF1基因抑制hRPE细胞的增殖。流式细胞仪检测显示转染后Go／G1期比例明显增加，S期比例减少。结论 p21／WAF1基因可有效地抑制hRPE细胞的增殖活性。     

硫酸软骨素A对NIH－3T3鼠成纤维细胞及人皮肤成纤维细胞增殖的影响

用ＭＴＴ法检测了硫酸软骨素Ａ（４－硫酸软骨素，ＣＳ－Ａ）对ＮＩＨ－３Ｔ３鼠成纤维细胞和人皮肤成纤维细胞存活与增殖的影响。发现所侧ＯＤ值随ＣＳ－Ａ浓度的增高而增大，两者呈正相关（３Ｔ３鼠成纤维细胞：ｒ＝０．８１５４，Ｐ＜０．０５；人皮肤成纤维细胞：ｒ＝０．９１５，Ｐ＜０．０１），表明ＣＳ－Ａ对这两类成纤维细胞的存活和增殖有促进作用。采用ＰＡＰ和ＡＢＣ免疫细胞化学染色，观察到两类细胞的胞膜上有ＣＳ分布，提示ＣＳ可能参与膜结构的组成，对细胞－细胞与细胞－基质之间的相互作用有重要意义；为进一步探讨硫酸软骨素在肝纤维化中的作用提供了可靠的实验依据。     

苦参素对NIH/3T3成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响

目的 观察苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及其细胞外基质(ECM)合成的影响,探讨苦参素抗肝纤维化的可能作用机制。方法 采用噻唑蓝比色法、流式细胞技术检测苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及细胞周期的影响,采用放射免疫方法检测苦参素对其合成透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)等ECM的影响。结果 苦参素可抑制NIH／3T3成纤维细胞的增殖,减少S期细胞,降低细胞增殖指数,抑制ECM的合成,并呈剂量依赖关系。结论 苦参素可能通过影响成纤维细胞的增殖、抑制成纤维细胞的分裂和ECM的合成发挥其抗肝纤维化作用。