血管形成抑制因子HIAF-1的克隆及其抗肿瘤作用

目的　克隆和表达一种新的血管形成抑制因子 ,并研究其抗肿瘤活性。方法　应用逆转录聚合酶链反应从人胎儿肝脏组织中克隆到一种新的血管形成抑制因子 (humaninhibitingangiogenesisfactor 1,HIAF 1) ,经测序后克隆到表达载体pET30a( )上 ,在E .coliBL2 1∶DE3菌中表达。用MTT法体外检测HIAF 1对内皮细胞的作用 ,采用小鼠乳癌自发性肺转移模型IVTA2MA 891,体内研究重组蛋白对肿瘤血管形成的作用和抑瘤作用。结果　从胎儿肝脏组织中首次克隆到人源血管形成抑制因子HIAF 1,经测序为人胶原ⅩⅧC 末端的一部分。在E .coli细胞中高效表达了该因子的重组蛋白 ,蛋白表达量为 88mg/L。体外实验表明HIAF 1能抑制内皮细胞的增殖 ,IC50 值为 7.5 μg/ml。动物实验表明该重组蛋白能够显著抑制肿瘤血管形成 ,原发瘤的生长 (抑瘤率为 46 .6 % )及肿瘤的转移 (抑制转移率为 6 8.9% )。结论　成功的克隆了血管形成抑制因子HIAF 1,其能够抑制肿瘤血管的形成 ,在肿瘤的治疗中显示出良好的应用前景。     

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。     

腺病毒介导PTEN基因抗脑胶质瘤作用的实验研究

目的：探讨10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)对人脑胶质瘤细胞的抗增殖作用，包括细胞周期改变、抗血管生成的作用。方法：用含PTEN基因的重组腺病毒载体，体外转染人脑胶质瘤细胞U87，用RTPCR、Western blot检测基因及蛋白的表达。通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测转染细胞的增殖、细胞周期的改变，用MTT法检测PTEN对人脐静脉内皮细胞生长的影响，体内实验检测其致瘤能力。结果：RT-PCR、Western blot检测转染AdPTEN病毒后的U87细胞PTEN表达由阴性转阳性，转染后对U87细胞的体外生长有明显抑制作用，使细胞出现G0～G1期阻滞，并抑制其体内肿瘤生长。含PTEN的上清对内皮细胞生长有明显抑制作用。体内实验表明，AdPTEN治疗组可明显抑制肿瘤的生长。结论：重组腺病毒载体介导的PTEN基因在体内外对人脑胶质瘤细胞L187的生长有抑制作用，并抑制肿瘤血管生成，具有显著的抗胶质瘤作用。     

反义 HSP70对人乳腺癌细胞的抑瘤效应

目的：观察反义热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70)RNA对人乳腺癌细胞学特性的影响,探讨其抗肿瘤作用。方法：将逆转录病毒真核表达载体介导的反义HSP70重组质粒pX-AHSP70和空载体pLXSN-neo转染至MCF7／Adr人乳腺癌细胞,通过细胞生长曲线和软琼脂集落实验以及裸鼠移植瘤实验观察转染反义HSP70重组质粒细胞的体内外抑瘤作用。结果：建立了稳定表达反义HSP70 RNA的MAp70细胞,与空载体细胞相比,HSP70蛋白的表达下降了48％。细胞群体生长速度明显减慢,软琼脂集落形成率和抑制率分别为6．08％和62．14％,裸鼠皮下接种的平均出瘤时间为15天,最终平均瘤重为108mg,以上参数与空载体细胞相比,均有显著差异。结论：反义HSP70RNA能够有效地抑制HSP70表达,进而抑制乳腺癌细胞的体外增殖和体内移植瘤的形成与发展。     

重组血管抑制剂CHM-I对骨肉瘤的治疗作用

目的：观察重组人软骨调节素（chondromodulin，CHM）蛋白对骨肿瘤的治疗作用。方法：利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM—I基因片段，并将其克隆到原核表达载体pET28a，在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白，将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养，观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响；将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤，观察其对肿瘤形成的影响。结果：获得纯化的重组人软骨调节素蛋白，该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响；重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。结论：重组人软骨调节索蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长，具有良好的临床应用价值。     

鸟氨酸脱羧酶和S-甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA腺病毒抑制食管癌细胞的增殖和侵袭

目的:探讨鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC) 和 S-甲硫氨酸脱羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC)的双反义RNA腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞增殖和侵袭的抑制作用.方法:重组腺病毒载体Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,应用Western blotting和HPLC分别检测双反义RNA腺病毒对食管癌细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺合成的抑制作用.采用活细胞计数法观察其对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响,采用Matrigel侵袭实验检测重组腺病毒载体感染对食管癌Eca109细胞侵袭活性的影响.同时应用裸鼠皮下移植瘤模型观察Ad-ODC-AdoMetDCas对移植食管癌生长增殖的抑制作用.结果:Western bloting证实Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白的表达,HPLC结果显示食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞内腐胺、精胺、精脒等3种多胺含量都明显降低(P<0.01).活细胞计数法表明Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有明显抑制作用(P<0.01),Matrigel侵袭实验结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas可显著降低食管癌Eca109细胞的体外侵袭能力(P<0.01).体内实验显示,双反义RNA腺病毒载体对已形成的裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01).结论:ODC和AdoMetDC双反义RNA重组腺病毒能显著抑制食管癌细胞的增殖和侵袭,具有食管癌基因治疗临床应用的潜在价值.     

重组人分泌型endostatin的纯化及其抑癌活性探讨

目的：纯化毕赤酵母菌GSll5株表达的分泌型人endostatin蛋白，并对其抑癌活性进行研究。方法：利用SepharoseG—25及Heparin亲和层析柱纯化重组蛋白，并以MTT法测定重组endostatin对人脐静脉血管内皮细胞(ECV-304)增殖的抑制活性；另以HepG2.2．15细胞注射裸鼠成瘤后，体内验证重组蛋白的抑瘤活性。结果：MTT结果显示纯化后的endostatin在体外可特异性抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，最高抑制率为86．0％；动物实验证明其可明显抑制荷瘤动物肿瘤的生长。结论：经纯化后的重组endostatin具有较强抑癌活性，将为临床抗血管生成治疗实体瘤研究奠定基础。     

熊果酸联合顺铂抑制卵巢癌生长的实验研究

目的：探讨熊果酸（UA）对卵巢癌细胞株SKOV3及卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用并探讨其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法,检测UA对SKOV3细胞的增殖抑制效应;建立卵巢癌皮下移植瘤模型,观察UA对移植瘤的生长抑制作用;用免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：UA对体外培养的SKOV3细胞生长具有抑制作用,与DDP联合应用使SKOV3细胞生长进一步受到抑制。体内实验表明：各治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,而联合治疗组抗瘤作用进一步增强。UA能下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达,同时明显提高肿瘤细胞中Bax蛋白的表达。结论：UA可明显抑制卵巢癌细胞生长,并诱导细胞凋亡,其主要机制与调节Bcl-2和Bax的蛋白表达有关。     

腺病毒介导人血管抑素抑制乳腺癌生长的研究

目的：研究腺病毒介导的重组人血管抑制Plasminogen K5基因对乳腺癌的治疗作用。方法：通过PCR将人血纤维蛋白酶原的信号肽基因加至Plasminogen的K5结构域基因，克隆到质粒pCA13，并在293细胞中同源重组，得到腺病毒AdK5。将Ad-K5体外感染乳腺癌细胞B－Cap-37和血管内皮细胞ECV304，观察其对细胞生长的影响，同时在乳腺癌的裸鼠动物模型上，检测其对肿瘤生长的抑制作用。结果：在感染Ad-K5的B－Cap-37细胞中检测到K5基因mRNA的表达。Ad-K5对血管内皮细胞ECV304有抑制作用，但对癌细胞B-Cap-37没有直接抑制作用。动物实验表明Ad-K5能显著抑制肿瘤的生长。结论：K5基因能抑制乳腺癌实体瘤的生长。     

内皮抑素基因对裸鼠移植骨肉瘤的抑制作用

目的：探讨内皮抑素（endostatin,ES）基因对裸鼠骨肉瘤细胞UMR106移植瘤的抑制作用。方法：携带ES基因重组质粒体外扩增后,应用脂质体法转染骨肉瘤细胞UMR106,Zeocin抗性筛选得到ES-UMR106细胞。MTT法观察ES基因对肿瘤细胞增殖的影响,ELISA法检测转染后肿瘤细胞的ES分泌情况。MTT法观察ES基因对血管内皮细胞增殖能力的影响。应用ES-UMR106和UMR106细胞制作裸鼠皮下移植瘤模型,观察两组动物移植瘤生长情况、瘤组织的病理变化及肺转移的情况。结果：ES基因转染不影响UMR106细胞的增殖能力;ES-UMR106细胞可表达有生物活性的ES,转染后48hES在培养液中超过350ng/ml。ES-UMR106细胞分泌的ES可明显抑制血管内皮细胞增殖。与UMR106细胞相比,ES-UMR106细胞在裸鼠接种的移植瘤生长速度缓慢、包膜完整,病理组织学显示瘤体内血管稀少,肿瘤细胞广泛坏死;UMR106细胞移植瘤裸鼠肺组织出现转移灶（2/8）,ES-UMR106细胞移植瘤裸鼠无肺转移灶。结论：携带ES基因重组质粒转染骨肉瘤UMR106细胞后可抑制该骨肉瘤细胞移植瘤的生长和转移。     

Her2/ECD-sf162/TM融合杆状病毒表达及鉴定

目的:获得融合表达的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒,为后续基于SIV Gag蛋白的Her2病毒样颗粒疫苗的制备奠定实验基础。方法:将Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM pFastBac重组表达载体,转座大肠杆菌E.coli DH10Bac菌株,获得重组杆粒,在昆虫细胞中表达获得重组杆状病毒,Western blot方法对该病毒进行鉴定。结果:构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒表达载体经PCR鉴定正确,转染昆虫细胞后获得了重组杆状病毒,该融合杆状病毒蛋白可与抗Her2抗体发生免疫反应。结论:成功构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒可用于Her2病毒样颗粒疫苗的制备。     

人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的：利用昆虫杆状病毒表达系统表达早期快速反应基因5（IER5）蛋白,为后续蛋白质结晶及探索蛋白质三级结构提供线索。方法：以HeLa细胞cDNA为模板扩增出IER5基因片段,构建重组转移质粒pFastBac1-IER5;重组转移质粒经双酶切及测序鉴定后转化至感受态细胞DH10Bac,以获得重组的穿梭质粒rBacmid-IER5;将重组穿梭质粒感染Sf9细胞,待细胞出现明显病变时收集重组杆状病毒;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot以及对表达产物进行分析鉴定。结果：重组转移质粒pFastBac1-IER5经双酶切后得到与预期相同的2条条带;重组穿梭质粒rBacmid-IER5经PCR鉴定在3 300 bp左右出现一条特异性条带;间接免疫荧光结果提示IER5蛋白在Sf9细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示,表达产物的相对分子质量约为48 k,Western blot结果表明表达产物能与IER5抗体特异性结合。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了人IER5蛋白,获得了体外表达重组IER5蛋白的相对分子质量、溶解性等物理化学特性。     

重组人内皮抑素的纯化及抗肿瘤活性研究

[目的]从高效表达的基因工程菌中纯化重组人内皮抑素,对其抗肿瘤活性进行研究.[方法]经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,重组人内皮抑素在大肠杆菌基因工程菌中以包涵体形式高效表达.通过凝胶层析纯化重组内皮抑素蛋白.应用鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM),肺癌细胞MTT试验及细胞迁移抑制实验,裸鼠皮下移植喉癌抑瘤实验、病理组织切片、免疫组化指标的测定等检测研究重组人内皮抑素的抗肿瘤活性.[结果]重组内皮抑素的复性率可达40%.重组内皮抑素在体外直接抑制肺癌细胞的增殖及迁移.用药21天,对裸鼠皮下移植喉癌的抑瘤率达到40.66%,HE染色、免疫组化及CAM实验表明其对肿瘤组织新生血管的生成有较强的抑制作用.[结论]重组人内皮抑素具有抑制肿瘤组织新生血管生成和直接抑制肿瘤细胞生长和迁移的双重抗肿瘤活性.     

miR-122-5p通过靶向CREB1抑制食管癌细胞及移植瘤的生长

背景与目的:miR-122在多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤细胞增殖、凋亡等,而cAMP反应元件结合蛋白1(cAMP response element-binding protein 1,CREB1)参与食管癌发展过程,研究miR-122-5p通过靶向CREB1对食管癌细胞及移植瘤生长的作用及机制.方法:选取2017年11...     

血管内皮生长因子反义RNA对裸鼠食管癌细胞增殖和凋亡的影响意义

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）反义RNA对裸鼠食管癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法：将转染VEGF反义eDNA和空载体peDNA3．1的食管癌细胞株TE-1分别接种在裸鼠体内；应用免疫组化法、RT-PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白和mRNA表达情况；流式细胞仪和透射电镜检测肿瘤细胞增殖及凋亡情况。结果：反义组肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达降低，肿瘤细胞的细胞器发生扩张和肿胀、核染色质边集、凝集成块等凋亡形态学改变；Go／G，期细胞明显增多，S期细胞明显减少，细胞增殖指数降低；对照组和空载体组细胞凋亡较少。结论：VEGF反义RNA能抑制裸鼠食管癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，为食管癌基因治疗基础研究提供依据。     

雄黄对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞凋亡的基础研究

目的:观察中药雄黄诱导卵巢癌细胞凋亡及血管生成的作用。方法:应用流式细胞术、荧光显微镜、透射电子显微镜和免疫组织化学等技术,以细胞凋亡和VEGF为主要观测指标,观察中药雄黄对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤抗肿瘤作用。结果:雄黄可诱导荷人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞凋亡,抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,阻止血管生成抑制细胞DNA的合成,并可延长小鼠存活时间。结论:雄黄可通过诱导卵巢癌细胞凋亡,阻止血管生成,抑制细胞DNA的合成等多种途径发挥抗肿瘤作用,具有广阔的应用前景。     

Soluble FLT-1 expression suppresses carcinomatous ascites in nude mice bearing ovarian cancer

Vascular endothelial growth factor (VEGF), a bifunctional protein enhancing vascular permeability and stimulating endothelial growth, is thought to be responsible for fluid accumulation and angiogenesis in ascites tumors. To investigate the effects of stable expression of the soluble form of Flt-1 VEGF receptor (sFlt-1), a known endogenous inhibitor of VEGF, on the malignant ascites tumors, we cotransduced RMG-1 human ovarian cancer cells with adeno-associated virus vectors carrying the sFlt-1 cDNA and Neo gene or Neo gene alone and isolated both the sFlt-1-expressing clone and the Neo-expressing clone. In vitro growth characteristics were essentially the same. As expected, conditioned medium collected from the sFlt-1-expressing cells significantly inhibited the human umbilical vein endothelial cell proliferation in the presence of recombinant VEGF. Expression of sFlt-1 significantly suppressed RMG-1 cell-induced angiogenesis in vivo in the mouse dorsal air sac assay model. We then inoculated sFlt-1- or Neo alone-expressing cells i.p. into female BALB/c nude mice. The average volume of ascites fluid, number of leaked RBCs, and number of cancer cells were significantly lower in mice injected with sFlt-1-expressing cells than in the controls. Survival time was significantly prolonged in mice injected with sFlt-1-expressing cells. These results suggest that inhibition of VEGF activity by sFlt-1 expression may provide a means to control carcinomatous ascites and angiogenesis of malignant ascites tumors.