Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

构建轻链次级库提高人抗TNF—α抗体的亲和力

目的：使用构建轻链次级库的方法,对已经获得的人源抗TNF－α单抗（mAb)的Fab进行轻链置换,并筛选具有更高亲和力的人源抗TNF－αmAb的Fab。方法首先,采用RT－PCR扩增正常人全套抗 轻链基因,并与已经获得的人源抗TNF－αmAb的重链基因配对,构建人源抗TNF－α噬菌体抗体的轻链次级库。然后筛选与TNF－α具有更高亲和力的克隆。结果,经过3轮的生物淘筛（biopanning),获得了较原来的人源抗TNF－αmAbFab具有更高亲和力的人源抗体Fab。结论轻链次级库筛选法,能有效地提高抗体的亲和力,为解决噬菌体抗体库法制备的人源抗体亲和力较低这一难题,提供了一种有效的方法。     

链替换技术提高抗角蛋白人Fab抗体的亲和力

目的通过链替换技术对一株人源性抗角蛋白Fab单抗进行体外亲和力成熟。方法分离、扩增多样性人免疫球蛋白轻链基因和IgG/IgM重链Fd段基因,分别构建轻链库和重链库。先以原始克隆的重链与轻链库随机搭配进行轻链替换,对形成的换链库采用解离速率筛选法（off-rate selection）选取亲和力提高的克隆;然后再将获得的轻链基因与重链库基因重组进行重链替换,筛选亲和力进一步提高的克隆并进行亲和力测定、可变区基因序列分析等一系列鉴定。结果替换轻链后所获抗体的亲和力提高到原来的10倍;替换重链后亲和力进一步提高达到7.9×10     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定

目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定.方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA.利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ和Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切,依次克降入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克降进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定.结果:构建了容量为3.13 × 107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆.氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性.阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合.结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础.     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段噬菌体呈现文库的构建、筛选及阳性克隆核苷酸序列测定

目的:构建一个经HBsAg主动免疫的人lgG1抗体噬菌体展示文库,通过特异的淘筛(panning)获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体,并测定其编码序列。方法:从一经乙肝疫苗免疫的自愿者的外周血分离淋巴细胞提取RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点,构建成噬菌体呈现库,并以HBsAg包被的96孔板对抗体库进行3轮淘筛,将所获克隆分别与HBsAg进行ELISA反应,挑取显色大于对照20倍以上的阳性克隆进行DNA测序。结果:lgG1的Fd段和κ轻链cDNA得到扩增,构建了一实际库容量为1.8×10⁵的噬菌体呈现文库。通过特异性淘筛,获得与HBsAg有较高新合力的3株Fab抗体并测定其编码序列。DNA序列测定结果表明,3株抗体中两株的Fd段完全一样,且3株的轻链完全一样。结论:成功构建了一个经HBsAg抗原免疫的人源抗体Fab段噬菌体抗体库,筛选得到了3株特异性抗体的Fab片段。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链

目的:以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板,筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。方法:利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因,克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中,电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序,对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定,以M13K07辅助噬菌体超感染,利用亲和纯化的γ-sm为抗原,对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定。最后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测。结果:构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库。利用纯化的γ-sm3轮亲和淘筛后,5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体。ELISA进一步检测表明,5个克隆均呈特异性阳性反应,其中2个克隆亲和力较高,测序显示其所含轻链基因序列完全相同,可变区来源于IGKV4-101胚系基因家族。结论:利用鼠源Fd片段为模板,导向筛选杂合噬菌体库,成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库

目的 :在嵌合HAb18 Fab抗体的基础上 ,利用载体pComb3X ,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库。方法 :用RT PCR自肝癌患者外周血单个核细胞 (PBMC)中 ,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因。首先 ,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中 ,建立人 -鼠杂合的Fab基因库 ,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原 ,筛选杂合的Fab基因 ,以得到人Fd基因。然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对 ,建立全为人Fab的基因库 ,并筛选全人Fab基因。将IPTG诱导的表达菌裂解 ,取其上清对pⅢ Fab融合蛋白的功能进行分析 ,并对其编码基因进行测序。结果 :建立了库容为 2× 10 7的杂合Fab基因库 ,经 6轮筛选后得到 7株杂合Fab基因。利用筛选的人Fd基因建立了库容为 0 .8× 10 7的全人Fab基因库 ,经 4轮筛选得到 2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因。测序结果显示 ,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列 ,与亲本抗体同属IgG2亚类 ;L链基因为κ型 ,可变区均属于Vκ3家族。结论 :利用导向选择链更替技术 ,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体 ,为进一步的工作打下了基础。