蛋白合成抑制剂促进TNFα诱导大肠癌细胞凋亡

目的 探索放线菌酮和TNFα协同诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡的发生规律。方法 用细胞体外培养方法。以放线菌酮和TNFα均小剂量作用于人大肠癌LoVo细胞,经Hoechst33258荧光染色,光镜观察形态改变,并用流式细胞术检测DNA断裂情况。结果 单用TNFα5万U/L或放线菌酮4mg/L,均未引起LoVo细胞凋亡效应,而两者协同,作用12h至48h,LoVo细胞逐渐出现明显的凋亡形态学改变和DNA断裂,结论 小剂量的放线菌酮和TNFα协同作用于人大肠癌LoVo细胞,出现明显的凋亡效应。     

蛋白合成抑制剂促进TNFα诱导大肠癌细胞凋亡

目的探索放线菌酮和ＴＮＦ。协同诱导人大肠癌Ｌ。ＶＯ细胞凋亡的发生规律。方法用细胞体外培养方法，以放线菌酮和均小剂量作用于人大肠癌ＬｏＶｏ细胞，经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８荧光染色，光镜观察形态改变，并用流式细胞术检测ＤＮＡ断裂情况。结果单用ＴＮＦａ５万［Ｊ／Ｌ或放线菌酮４ｍｇ／Ｌ，均未引起ＬｏＶｏ细胞凋亡效应。而两者协同，作用１２ｈ至４８ｈ，ＬＯＶＯ细胞逐渐出现明显的凋亡形态学改变和ＤＮＡ断裂。结论小剂量的放线菌阴和ＴＮＦＱ协同作用于人大肠癌Ｌ。ＶＯ细胞，出现明显的凋亡效应。     

RNA干扰靶向抑制P13K p85α表达对5-FU诱导大肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨应用RNA干扰靶向抑制P13K p85α表达对5-FU诱导大肠癌LoVo细胞凋亡的影响.方法 培养已成功沉默P13K p85α表达的大肠癌LoVo细胞(P13K p85α/RNAi-LoVo)及LoVo对照组细胞,MTT法计算两组细胞5-FU的半数抑制率(IC50),JC-1染色检测线粒体膜电位(△ψm)的变化.Western blotting检测凋亡蛋白Bcl-6和Bim的表达.结果 P13K p85α/RNAi-LoVo细胞组5-FU的IC50值(1.056±0.03562μmol/L)显著低于LOVo对照组(2.796±0.10947μmol/L)(P=0.000),JC-1染色显示5-FU刺激48 h后,P13K p85α/RNAi-LoVo细胞线粒体膜电位较LoVo对照组细胞显著降低,表明P13K p85α/RNAi-LoVo细胞对5-FU更敏感.5-FU刺激48 h后,P13K p85α/RNAi-LoVo细胞组凋亡蛋白Bcl-6和Bim的表达较LoVo对照组细胞显著增加(P=0.000).结论 应用RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达可促进5-FU诱导大肠癌细胞LoVo的凋亡.     

肝细胞生长因子对TNF-α诱导肝细胞凋亡的保护作用及其机制的研究

目的 :探讨肝细胞生长因子对肿瘤坏死因子α(TNF -α)诱导的肝细胞凋亡的保护作用以及可能的机制。方法 :选择第 3代人类肝细胞系 (L0 2细胞 ) ,分成三组 :Ⅰ组 ,正常L0 2细胞 ;Ⅱ组 ,10 0 0 0u/mlTNF -α损伤L0 2细胞 2 4h ;Ⅲ组 ,重组肝细胞生长因子 (r -hHGF ,5ng/ml)与L0 2细胞共同孵育 30min后加入 10 0 0 0u/mlTNF -α ,2 4h后处理细胞。观察“Ladder”条带、细胞DNA断裂百分率和用Westernblot印迹分析法检测HSP70和IκB -α的表达。结果 :Ⅱ组DNA电泳出现典型的“梯状”条带 ,而Ⅲ组则未见明显的“梯状”条带。DNA断裂百分率Ⅱ组比Ⅰ组高 (分别为 17.12± 4 .0 2和 5 .0 5± 1.6 7,P <0 .0 1) ,Ⅲ组比Ⅱ组低 (分别为 8.77± 2 .0 1和 17.12± 4 .0 2 ,P <0 .0 1)。重组肝细胞生长因子预处理后再用TNF -α损伤的L0 2细胞 ,1h即可检测到HSP 70的表达 ,且持续到 4 8h。肝细胞生长因子还抑制了TNF -α引起的L0 2细胞IκB -α量的减少。结论 :重组肝细胞生长因子可减轻TNF -α诱导的L0 2细胞凋亡 ,它通过诱导L0 2细胞HSP 70的表达和抑制IκB-α的降解达到减轻L0 2细胞的凋亡。     

苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响

目的:观察苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响.方法:采用MTT比色法分别观察20、40、60、80和100 mg/L MAP30处理48 h及40 mg/L MAP30处理24、36、48和72 h对LoVo细胞生长的影响,计算细胞生长抑制率.采用流式细胞仪检测40 mg/L MAP30处理24 h对LoVo细胞凋亡的影响.采用Northern blot和Western blot分别检测40 mg/L MAP30作用于LoVo细胞0～120 h,细胞bcl-2和bax基因和蛋白的表达.结果:MAP30可呈剂量、时间依赖性抑制LoVo细胞的生长(F=128.3,107.5,P＜0.05),促进LoVo细胞凋亡(F=92.7,P＜0.05).MAP30还可上调Bax基因与蛋白表达,下调Bel-2基因与蛋白的表达.结论:MAP30可影响LoVo细胞Bcl-2和Bax的表达,从而诱导细胞凋广,抑制细胞生长.     

Nrf3基因对大肠癌LoVo细胞系生长的影响

目的:在体外检测Nrf3基因对大肠癌LoVo的生长影响作用。方法:构建其融合蛋白真核表达载体,脂质体介导该真核表达载体转染大肠癌LoVo细胞系,FCM观察其在体外对大肠癌LoVo细胞系细胞周期和凋亡的影响;荧光显微镜观察候选基因亚细胞定位。结果:构建融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1-Nrf3。RT-PCR方法检测Nrf3的表达,与芯片检测结果基本一致。荧光显微镜下观察Nrf3定位于细胞核内。FCM分析显示Nrf3影响下LoVo G2/M S期细胞所占比例较对照组明显减少,G0/G1细胞所占比例明显增加。证实Nrf3可抑制大肠癌LoVo细胞的DNA合成和有丝分裂,促使细胞阻滞于G0/G1期,抑制大肠癌LoVo细胞的体外生长。FCM分析显示Nrf3在体外对大肠癌LoVo细胞的凋亡无影响。结论:Nrf3在体外具有抑制大肠癌增殖的功能,对大肠癌的细胞凋亡无影响,为肿瘤抑制基因。     

热休克蛋白90在抑制细胞凋亡中的作用

目的：探讨热休克蛋白90（HSP90）是否能够抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）和放线菌酮（CHX）协同诱导的细胞凋亡.方法：采用电穿孔技术建立稳定过表达HSP90的细胞克隆,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TNF-α/CHX协同诱导的细胞凋亡.结果：在稳定过表达HSP90的小鼠成纤维细胞系NIH3T3中,HSP 90能够抑制TNF-α/CHX协同诱导的细胞凋亡;在TNF-α/CHX协同诱导的细胞凋亡中,HSP 90持续稳定存在12 h以上.结论：HSP 90能够抑制TNF-α/CHX协同诱导的细胞凋亡.     

人纤溶酶原激活剂抑制物-2型可抑制TNFα诱发的细胞凋亡

目的　研究纤溶酶原激活剂抑制物 2型 (PAI 2 )抑制细胞凋亡的分子机制。方法　用TNFα与放线菌酮协同诱发HeLa细胞建立HeLa细胞凋亡模型 ;将人PAI 2cDNA与真核表达载体 pcDNA3重组 ,构建PAI 2真核表达质粒并转染HeLa细胞 ,经G4 18筛选 ,NorthernBlot、WesternBlot鉴定筛选出稳定表达PAI 2的细胞株 ;运用结晶紫染色和MTT法检测表达PAI 2的HeLa细胞株对TNFα诱发细胞凋亡作用的抵抗作用 ,并检测胞外添加PAI 2对TNFα作用的影响和PAI 2对有H2 O2 引起的细胞损伤作用的影响。结果　HeLa细胞经TNFα诱导后发生凋亡 ;而PAI 2转染HeLa细胞后获得的三株表达克隆对TNFα诱导的细胞凋亡有明显的抵抗作用 ,对由H2 O2 引起的细胞凋亡无明显影响 ;胞外添加PAI 2对TNFα的作用无影响。结论　细胞内PAI 2的表达能抑制由TNFα引起的细胞凋亡 ,而对由H2 O2 引起的细胞凋亡无影响。     

重组人穿孔素协同TNF-α对HIV感染CD4~+细胞的影响

目的 观察重组人穿孔素协同TNF-α对HIV感染CD4 细胞的影响.方法 HIV-1SF33感染MT4细胞,加入重组人穿孔素和TNF-α作用24 h.倒置显微镜观察细胞形态,单细胞凝胶电泳技术观察DNA损伤情况,吖啶橙/溴乙啶双荧光染色和原位(缺口)末端标记法检测细胞凋亡.结果 HIV感染MT4细胞形态尚好,仅出现荧光团,可见个别凋亡细胞;单纯TNF-α作用后,胞浆内可见少量颗粒,部分细胞核出现弥散和微量的彗星拖尾现象,凋亡细胞较正常对照组增多;穿孔素和TNF-α协同作用后,部分细胞体积变小,细胞内颗粒增多,明显的彗星拖尾现象,凋亡细胞数增多.结论 穿孔素协同作用可明显增强TNF-α致HIV感染CD4 细胞的凋亡.     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的 探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFP-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用.方法 分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应.结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应.而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异.结论 VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似.     

转录因子NF-kB在肿瘤坏死因子α介导的胰岛β细胞凋亡中的作用

目的 探讨肿瘤坏死因子(17NFα)是否可引起胰岛B细胞凋亡以及转录因子核因子kB(NF—kB)在TNFα诱导的β细胞凋亡中所起的作用。方法培养INS-1胰岛β细胞,采用DNA重组、转染和再感染技术获得可表达NF—kB的特异性抑制物：IkBα的突变体IkBα△N的INS-1／IkB△N细胞。应用DNA片段分析技术和kB—luc报告基因荧光分析技术观察NF—kB活性和β细胞的凋亡情况。结果IL—Iβ可诱导INS-1细胞的NF—kB激活,但在INS-1／IkB△N细胞则无此作用。将细胞与IL-1β(10μg/L)、TNFα(100μg/L)以及IFNγ(100000U／L)一道培养48h后显示,TFNFα与IFNγ合用可诱导INS-1细胞发生凋亡,而在INS-1／IkB△N细胞未见此现象。单用IL—Iβ或IFN-γ或IL—IB加IFNγ均未能诱导INS-1细胞凋亡。结论凋亡是TNFα导致B细胞死亡的方式之一,NF—kB在TNFα介导的β细胞凋亡中具有重要作用,抑制NF—kB激活可能保护β细胞免于TNFα诱导的凋亡。     

共培养体系中TGF-β1沉默大肠癌LoVo细胞对巨噬细胞IL-12和TNF-α分泌的影响

目的研究TGF-β1沉默人大肠癌LoVo细胞对人巨噬细胞系28SC免疫功能的影响。方法将构建的TGF-β1siRNA稳定表达LoVo细胞与人巨噬细胞系28SC共培养,酶联免疫吸附实验检测培养液中IL-12和TNF-α水平,同时设立对照组空载体pSUPER-neo-gfp稳定转染LoVo细胞＋28SC。结果 TGF-β1siRNALoVo＋28SC组IL-12和TNF-α分泌量高于对照组（均P〈0.05）;TGF-β1＋28SC组IL-12和TNF-α分泌量与LoVo＋28SC组之间无明显差异（P〉0.05）。结论大肠癌LoVo细胞分泌的TGF-β1能通过影响IL-12和TNF-α的分泌抑制巨噬细胞的免疫功能,有望通过阻断TGF-β1信号转导改善肿瘤免疫微环境抑制大肠癌的发生发展。     

阻断磷脂酶C-γ1信号通路对大肠癌细胞凋亡的影响

目的探讨磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号通路被阻断对大肠癌细胞凋亡状态的影响。方法利用U73122(1、5、10μmol/L)处理细胞以阻断PLC-γ1信号通路,光镜、电镜观察细胞形态改变,MTT法评估细胞杀伤效应,流式细胞仪分析凋亡细胞比例。结果PLC-γ1信号通路阻断后,大肠癌细胞出现了典型的凋亡形态学改变,存活细胞明显减少,流式细胞仪检测出现典型的凋亡亚二倍体峰,凋亡细胞所占比例达到半数以上。结论阻断PLC-γ1信号通路能够启动大肠癌细胞凋亡。     

重组苦瓜MAP30蛋白对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响

目的:克隆及重组苦瓜蛋白MAP30,观察MAP30对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响.方法:RT-PCR法克隆MAP30基因的cDNA序列,并表达、纯化MAP30蛋白;MTT法测定纯化的MAP30蛋白对LoVo细胞的生长抑制作用;彗星实验观察MAP30引起凋亡的LoVo细胞基因组的降解情况.结果:成功克隆了苦瓜蛋白MAP30基因;MAP30蛋白对LoVo细胞体外生长具有抑制作用;MAP30蛋白对LoVo细胞半数抑制质量浓度(IC50)为70.0 mg/L.MAP30在体外能诱导LoVo细胞凋亡.结论:重组的苦瓜MAP30蛋白在体外能抑制LoVo细胞生长,并能诱导其凋亡.     

三氧化二砷诱导人胆管癌细胞系QBC939凋亡的实验研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对体外培养的QBC939细胞的生物学效应和作用机制.方法 MTT法检测As2O3对QBC939细胞的增殖抑制作用,电子显微镜观察细胞超微结构改变,琼脂糖凝胶电泳测定DNA ladder,流式细胞术检测细胞DNA含量,半定量RT-PCR检测p53/bax/bcl-2 mRNA的表达水平.结果 As2O3对QBC939细胞的增殖抑制作用随浓度升高和作用时间的延长而明显增强,并以4 μmol/L As2O3作用96 h抑制率达最高(90.2%),流式细胞术显示正常生长的QBC939细胞自发性凋亡率为2.94%,各实验组均出现程度不等的亚二倍体峰,并以4 μmol/L As2O3作用96 h凋亡率达最高(87.7%),透射电镜显示1 μmol/L As2O3作用72 h出现早期凋亡特征,4 μmol/L 作用48 h出现典型凋亡特征;DNA ladder测定显示随着浓度和时间的增加,ladder条带越来越明显;半定量RT-PCR显示4 μmol/L As2O3作用24、48、72 h后显示bax上调和bcl-2的下调,p53则未检测到表达.结论在体外As2O3能有效地抑制QBC939细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与bax上调、bcl-2下调有关.     

pHGF对TNF-α体外介导小鼠肝细胞凋亡的抑制作用

目的：探讨促肝细胞生长因子（pHGF）对肿瘤坏死因子－α（TNF－α）介导小鼠原代肝细胞凋亡和坏死的抑制作用。方法：采用原位灌洗法分离小鼠肝细胞，体外培养后分别加入TNF-α、GalN、TNF－α＋GalN＋pHGF5h、10h、20h和30h后,观察小鼠肝细胞的形态及生化改变，测定培养上清液ALT和AST。结果：TNF－α单独作用于培养肝细胞，无肝细胞凋亡和坏死，经GalN致敏后，TNF－α可诱导大量肝细胞凋亡（10h ),随后（20h后）出现肝细胞坏死，其程度随培养时间延长和药物剂量的增加而明显。单独使用GalN也可造成肝细胞凋亡和坏死，但程度较TNF－α＋GalN合用轻，加用pHGF后可使肝细胞凋亡坏死明显减少，其效应在一定药物剂量范围内成正比。结论：pHGF对TNF－α诱导肝细胞凋亡和坏死具有抑制作用。     

趋化因子受体CXCR4小干扰RNA对人大肠癌细胞株迁移的抑制作用

目的:探讨趋化因子受体CXCR4小干扰RNA(siRNA)对人大肠癌细胞株迁移的抑制作用.方法:采用RT-PCR、Western印迹和体外迁移实验检测趋化因子受体CXCR4在大肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo 细胞的表达及迁移能力.将与CXCR4 mRNA互补的 siRNA及非抑制性双链RNA(Non-silencing dsRNA),在脂质体介导下以150 nmol/L终浓度转染大肠癌细胞SW480,以RT-PCR和Western印迹法检测CXCR4表达的变化,Transwell迁移实验检测大肠癌细胞SW480迁移的变化.结果:大肠癌细胞SW480高表达CXCR4,大肠癌细胞LoVo低表达CXCR4,SW620的CXCR4表达水平介于二者之间.与LoVo 细胞相比,SW480和SW620迁移细胞明显增多(P＜0.01).与对照组、脂质体组和Non-silencing dsRNA组相比,siRNA组SW480细胞内CXCR4 mRNA和蛋白均明显降低,细胞迁移被明显抑制 (P＜0.01).结论:CXCR4 siRNA可通过下调CXCR4的表达抑制人大肠癌细胞SW480的迁移.     

Fas转导大肠癌细胞诱导其凋亡的实验研究

目的：观察Fas转导大肠癌细胞株诱导大肠癌细胞凋亡效应，可望为进一步研究大肠癌的Fas基因治疗提供实验依据。方法：以流式细胞术(FCM)及琼脂糖凝胶电泳法捡测Fas转导大肠癌细胞调亡效应。实验分四组：a.LoVo细胞组b．LoVo细胞 Fas抗体组c.LOVo转导细胞组dLoVo转导细胞 Fas抗体组。结果：Fas转导大肠癌细胞株 Fas抗体组(d)细胞凋亡率明显高于a,b,c组。结论：Fas表达细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径。     

EGCG对大肠癌细胞系LoVo细胞增殖的影响及其机制

目的:探讨EGCG对大肠癌细胞系LoVo细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养的LoVo细胞,用不同浓度EGCG处理24、48、72 h,MTT法测定其对LoVo细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察细胞的形态学变化;EGCG(浓度分别为10、40、80μg/m L)处理LoVo细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度计检测Casepase-3相对活性、RT-PCR和western blot法检测环氧合酶2(COX-2)基因表达情况。结果:EGCG(浓度10~80μg/m L)能显著抑制LoVo细胞增殖,呈剂量和时间依赖性;倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态;EGCG(浓度分别为10、40、80μg/m L)作用LoVo细胞48 h后,细胞凋亡率分别为12.5%、23.3%、35.4%,对照组凋亡率为3.4%;Casepase-3相对活性显著增加;COX-2的表达降低,呈剂量依赖性。结论:EGCG能抑制LoVo细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与增加细胞Casepase-3活性及下调COX-2基因的表达有关。EGCG有望成为代替NSAIDs或COX-2特异性抑制剂用于大肠癌防治。     

Daxx在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的 初步探讨Daxx在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡中的作用.方法 通过MTT比色法检测ox-LDL对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7)细胞生长的影响:用AO/EB染色、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究ox-LDL诱导的细胞凋亡.eal time PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达情况.结果 ox-LDL能抑制RAW264.7细胞的生长,抑制作用呈剂量-效应关系;50 mg/L ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h后,AO/EB染色细胞呈凋亡特征性改变,并且DNA断裂片段分析显示电泳图出现梯形条带;流式细胞检测显示相同时间不同浓度ox-LDL(0、12.5、25、50、75 mg/L)处理RAW264.7细胞48 h和相同浓度不同时间(50 mg/L,48、72 h)处理细胞,细胞凋亡率逐渐升高;Real time PCR结果表明不同时间和不同浓度的ox-LDL处理RAW264.7细胞后,Daxx mRNA表达水平呈时间和浓度依赖性增加,其中50 mg/L ox-LDL处理细胞48 h组Daxx mRNA表达最高.结论 ox-LDL有诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的作用,其机制可能与Daxx表达增高从而启动细胞凋亡有关.