反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

目的:建立CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^-细胞系,研究CROC- 1 基因在细胞生长中的作用。方法: 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC- 1 的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp^-中,经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC- 1 反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC- 1 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选,测定G418抗性的FL-CROC- 1 ^- 细胞系的生长速度。 结果:建立的FL-CROC- 1 ^- 细胞系在地塞米松诱导下CROC- 1 基因表达被反义抑制后,其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp^- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P＜0.05)。结论: 本研究成功地建立了CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^- 细胞系,并提示CROC- 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。     

p21wafl在1, 25(OH)2D3调节人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖分化中的作用

目的:探讨p21^wafl在1, 25(OH)₂D₃调节人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖中的作用。方法: 用定量RT-PCR法检测1, 25(OH)₂D₃对p21^waflmRNA表达的诱导作用, 并构建稳定表达p21^wafl真核表达载体的细胞系HOS-p21^wafl进一步观察该细胞的生长及分化情况。结果:1, 25(OH)₂D₃作用2h即可诱导HOS-8603细胞内源性p21^wafl的表达, 4h达高峰, 24h仍未回降。细胞过度表达p21^wafl后生长速度明显减慢, 培养6d时细胞数为未转染细胞的50%;并且组织化学染色结果表明细胞的分化标志性抗原碱性磷酸酶(AKP)的表达明显增强。结论:表明1, 25(OH)₂D₃对p21^waflmRNA诱导作用可能是激素调节细胞增殖分化的重要机制之一。     

纳豆激酶酶原基因的克隆、融合表达及活性测定

目的:利用基因工程技术, 构建表达具溶栓活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法:利用PCR方法扩增纳豆激酶酶原(pro-NK)基因, 并克隆到表达载体pET3c上, 构建表达pro-NK和载体上22氨基酸短肽的融合蛋白的表达质粒pENK;表达质粒pENK分别转化溶源化宿主菌BL21(DE3)pLysS^-和BL21(DE3)pLysS⁺, 获得表达菌pENK-(DE3)pLysS^-和pENK-(DE3)pLysS⁺。利用SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测目的蛋白的表达及活性。结果:SDS-PAGE显示两株菌株均表达42kD的目的蛋白。纤维蛋白平板法显示表达产物具溶栓的活性。在pENK-(DE3)pLysS^-中融合蛋白不需异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导就有基础表达, 融合蛋白的表达使表达菌细胞溶解, 菌落中空, 表明表达产物具细胞毒作用。结论:本研究成功实现了在大肠杆菌表达具有溶栓活性的pro-NK融合蛋白, 为开发纳豆激酶成为新一代溶栓药物的研究奠定基础。     

吸烟大鼠一氧化氮合酶和一氧化氮的变化

目的:观察吸烟对大鼠肺组织iNOS、eNOSmRNA和蛋白表达以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中NO的影响, 探讨不同类型的NOS在吸烟所致慢性气道炎症中的作用。方法:选用Wistar大鼠80只随机分为对照组, 被动吸烟组, iNOS抑制剂L-NIL干预组及NOS抑制剂L-NAME干预组。用免疫组化法检测iNOS及eNOS的蛋白表达, 用RT-PCR检测iNOS及eNOSmRNA的表达, 用Griess法测定BALF中的NO^-₂/NO^-₃含量。结果:吸烟大鼠肺组织中iNOSmRNA及其蛋白表达增加, eNOSmRNA及蛋白表达下降, BALF中细胞总数及NO^-₂/NO^-₃显著增加(P＜0.05)。在体实验发现, L-NIL使BALF中细胞总数及NO^-₂/NO^-₃下降(P＜0.05);L-NAME对BALF中细胞总数及NO^-₂/NO^-₃无显著影响(P＞0.05)。结论:吸烟大鼠肺组织iNOSmRNA和蛋白表达增加, eNOSmRNA和蛋白表达减少。活化的iNOS产生大量NO促进炎症发展。     

反义多重耐药性基因抑制眼睫状体非色素上皮细胞容积激活性氯电流

目的:研究多重耐药性(MDR1)基因及其产物P糖蛋白(P-gp)与容积激活性Cl^-电流的关系。方法:用膜片钳全细胞记录技术记录牛眼睫状体非色素上皮(NPCE)细胞容积激活性Cl^-电流,反义寡核苷酸阻抑细胞MDR1基因表达,在激光共聚焦显微镜下检测细胞P-gp免疫荧光。结果:P-gp免疫荧光与人源反义MDR1呈剂量依赖性减弱关系,容积激活性Cl^-电流被人源反义MDR1特异性地部分阻抑,电流潜伏期延长,峰电流值减少,电流抑制率与人源反义MDR1呈现剂量依赖性增强关系,(r=0.99, P＜0.01)。 P-gp表达抑制率和容积激活性Cl^-电流抑制率高度正相关(r=0.99, P＜0.01)。结论: MDR1基因及其产物P-gp参与NPCE细胞容积激活性Cl^-电流的形成。     

反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的 非定标性突变的发生率

目的 :ＲＥＶ3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的ＤＮＡ聚合酶 ,参与真菌易误性复制后修复通路。本研究采用反义核酸技术建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断的人胚肾细胞系 ,研究它与非定标突变形成的关系。方法 :1 ｈＲＥＶ3基因片段从ｐＢＳ -ｈＲＥＶ3反向重组入载体ｐＭＡＭｎｅｏ -ａｍｐ 构建真核反义诱导表达质粒。 2 重组质粒转染ＨＥＫ2 93细胞 ,Ｇ41 8全培养基筛选建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断细胞系。 3 细胞系生长速率及ＭＮＮＧ敏感性检测 :以ｈＲＥＶ3基因表达反义阻断细胞系为实验组 ,转染有空载体的细胞系以及母本细胞系为对…     

维生素D受体在1,25(OH)2D3调节人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖中的作用

目的:研究维生素D₃受体(VDR)在1,25(OH)₂D₃及其类似物调节人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖中的作用。方法:用RT-PCR和免疫组织化学技术分别在mRNA和蛋白水平上明确HOS-8603细胞中是否有VDR表达;瞬时转染VDR报告基因技术观察HOS-8603细胞中VDR的功能活性;并进一步利用稳定表达VDR反义mRNA的细胞株VDRas3细胞研究VDR被阻断后细胞增殖以及基因转录的变化。结果:HOS-8603细胞有VDR表达,此内源性VDR具有激素依赖性的转录激活活性。在内源性VDR被阻断后,1,25(OH)₂D₃及其类似物对细胞增殖的抑制作用以及对VDR的靶基因p21mRNA表达的诱导作用均明显减弱。结论:1,25(OH)₂D₃及其类似物对HOS-8603细胞增殖抑制作用是由VDR介导的。     

细胞因子诱导的杀伤细胞的生物学特性研究

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的生物学特性。方法:健康人非贴壁单个核细胞用含IFN-γ、IL-1β、IL-2、CD3单抗诱导CIK细胞。以LAK细胞作为对照。流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测细胞表型特征;乳酸脱氢酶释放法分析细胞毒活性。结果:诱导2周后,CIK细胞的增殖率达到高峰,CD3⁺细胞占95％以上;第3周细胞生长进入平台期。诱导15d时,CD3⁺CD56⁺NKT亚群占16.5％,比例在2-4周区间内无明显变化。LAK细胞增殖缓慢,显著低于同期CIK细胞增殖率(P＜0.01)。不同效:靶比例CIK细胞对肝癌细胞BeL-7402的特异性溶解率显著高于LAK细胞(P＜0.01)。免疫细胞化学染色结果显示,CIK细胞高度表达HLA-DR和CD54抗原,NKT细胞体积较CD3⁺CD56^-细胞略大,细胞表面有大量伪足。结论:CIK细胞具有高度增殖能力,其体外杀瘤活性明显优于LAK细胞。诱导14-21d,CIK细胞增殖率和CD3⁺CD56⁺阳性细胞率均达到高峰,此时期的CIK细胞适合临床应用。     

载脂蛋白E在ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出中的作用

目的:探讨载脂蛋白E(ApoE)在ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)和ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)介导的胆固醇流出中的作用及可能机制。方法:将RAW264.7细胞随机分为3组:空白对照组:用单纯培养基培养;低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLr^-/-)组:用20mg/LLDLr^-/-小鼠脂蛋白处理细胞;ApoE基因敲除(ApoE^-/-)组:用20mg/LApoE^-/-小鼠脂蛋白处理细胞。采用透射电镜和酶法检测细胞内脂质含量,用液闪仪技术检测胆固醇流出变化,用免疫印迹技术和实时定量PCR技术检测ABCA1和ABCG1的表达水平。结果:与对照组相比,LDLr^-/-小鼠脂蛋白处理后细胞内脂质含量并未明显改变,而ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理48h后,细胞内胆固醇酯增加了60%;同时,与LDLr^-/-小鼠脂蛋白处理组相比,用ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理后,巨噬细胞胆固醇流出至载脂蛋白A-I(ApoA-I)和高密度脂蛋白(HDL)的量均明显降低。与对照组相比,LDLr^-/-小鼠脂蛋白和ApoE^-/-小鼠脂蛋白处理显著增加ABCA1和ABCG1的蛋白和mRNA水平,但是ApoE^-/-小鼠脂蛋白对ABCA1和ABCG1蛋白和mRNA水平的诱导程度明显低于LDLr^-/-小鼠脂蛋白。结论:ApoE在介导巨噬细胞胆固醇流出中发挥重要作用,该作用与其调节ABCA1和ABCG1的表达水平有关。     

siRNA干扰 BMI-1 基因对膀胱癌EJ细胞增殖的调控作用及其机制

目的: 对比观察膀胱癌EJ细胞及人膀胱移行上皮细胞中 BMI-1 基因及下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的mRNA及蛋白表达水平,探讨siRNA干扰 BMI-1 基因后对EJ细胞增殖的影响及其调控机制。方法: 细胞免疫荧光观察BMI-1、p16^INK4a和p14^ARF蛋白在EJ细胞中表达情况及定位。Real-time RT-PCR检测EJ细胞及膀胱正常移行上皮细胞中3种基因的表达水平,Western blotting检测蛋白水平。构建干扰 BMI-1 基因siRNA,通过脂质体转染导入EJ细胞中,设立空白对照和阴性干扰对照组,检测 BMI-1 及下游 p16、p14 基因表达水平及蛋白表达水平的变化;以CCK-8检测细胞生长观察siRNA干扰 BMI-1 表达对EJ细胞增殖的抑制作用;用流式细胞术分析细胞凋亡的改变。结果: BMI-1mRNA及蛋白水平在EJ细胞表达高于膀胱移行上皮细胞,而p16^INK4a和p14^ARFmRNA及蛋白在EJ细胞表达水平稍低于膀胱移行上皮细胞。siRNA干扰 BMI-1 后可以上调EJ细胞中其下游p16和p14 mRNA及蛋白水平,使EJ细胞增殖能力下降,细胞凋亡增多。结论: siRNA干扰 BMI-1 基因表达对EJ细胞的体外生长具有明显的抑制作用,其作用机制与上调其下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的表达有关。     

Hela—MSH2^—细胞的生物学特性

凝胶阻滞实验证实转染了本实验室构建的ｈＭＳＨ２反义ＲＮＡ表达质粒的Ｈｅｌａ细胞（Ｈｅｌａ－ＭＳＨ２＾－细胞），其细胞抽提物中Ｇ．Ｔ碱基对和Ａ．Ｃ碱基对错配合蛋白表达明显降低，该细胞系细胞与母本Ｈｅｌａ细胞在生长速率方面无差异，但经十几次传代后，其生长速率加快给两倍，出现了次磺酸磷酸核糖转移酶（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｈｇｐｒｔ）自发突变率升高，但不     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的：转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用。 方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达情况及对ADR敏感性的变化。 结果：转染后的细胞生长明显减慢，凋亡率显著增加，MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达明显降低，对ADR的耐药性明显下降，敏感性增加。 结论：联合运用不同的逆转耐药机制，将TNF-α cDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中，能有效达到逆转耐药的目的。     

表达载体介导的反义RNA抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的：研究表达载体介导的反义RNA对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。 方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义RNA的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，建立可表达MIF反义RNA的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA的表达水平。 结果:正确构建了MIF反义RNA的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF 反义RNA对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%（P<0.05）。建立稳定表达MIF反义RNA的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制，表达水平降低40%（P<0.05）。 结论:表达载体介导的反义RNA能有效地抑制MIF的表达，建立了稳定表达MIF反义RNA的HUVECs。     

siRNA对神经胶质瘤细胞株U251 bcl-2基因表达的抑制

目的：研究siRNA(small interference RNA)对bcl-2基因表达的抑制作用。 方法： 依据Ambion公司在网上提供的设计软件，设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA，通过脂质体将合成的siRNA转入U251细胞株，以未转染细胞以及bcl-2的反义药物G3139为对照，经MTT法检测siRNA对细胞生长的抑制以及流式细胞仪检测细胞周期的改变，用RT-PCR和免疫组织化学法检测siRNA对bcl-2表达的抑制作用。 结果： MTT显示各时点细胞生长以及存活率，在siRNA 2、3、5、6与siRNA 1、4组以及对照组和脂质体组间均有显著差异（P<005）。siRNA 1、4组与对照组和脂质体组也有差异（P<005）。siRNA 1-6组与反义组在24和48 h均有显著差异(P<005)，在72 h无显著差异（P>005）。RT-PCR以及免疫组织化学法显示，siRNA 2、3、5、6组bcl-2基因表达明显低于对照组、脂质体组、反义组以及siRNA 1、4组（P<005）。流式细胞仪检测细胞周期结果显示， siRNA 1-6组以及反义组细胞阻滞于S期。 结论： 体外转录合成的siRNA可抑制U251细胞bcl-2基因的表达，效率可达50%以上。     

反义核酸抑制miR-20、miR-106表达对293T细胞增殖的影响

目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关靶基因的表达。结果:研究发现反义核酸可有效抑制miR-20和miR-106的表达,并明显抑制293T细胞的增殖;研究还表明反义miR-106可明显上调抑癌基因Rb的表达。结论:反义核酸通过抑制miRNA表达,上调抑癌基因Rb的表达,能明显抑制293T细胞增殖。     

表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体,为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３基因功能４及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶ＢａｍＨⅠ及Ｂａｍ ＨＩ＋ＨｉｎｄⅢ分别对ｐＢＳ－ｈＲＥＶ３进行单酶切和双酶切,从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ特异性保守序列的两种长度片段,分别将两者插入真核细胞载体;ｐＢＫ－ＲＳＶ和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ＾－。     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

BCL-3基因沉默对BCL-3高表达的人大肠癌RKO细胞增殖和药物敏感性的影响

 目的：构建针对人BCL-3基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,观察其对大肠癌细胞株中BCL-3基因的沉默效应,以及基因沉默对细胞生物学行为及药物敏感性的影响。方法：运用RT-PCR及Western blotting方法检测5株大肠癌细胞株中BCL-3的表达状况;构建人BCL-3基因的RNAi慢病毒载体,并转染BCL-3高表达的大肠癌细胞株,运用Western  blotting方法鉴定其对BCL-3基因的沉默效果;BCL-3基因沉默后运用细胞增殖实验及软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响,运用MTT方法检测大肠癌细胞株对化疗药物敏感性的变化。结果：BCL-3高表达于大肠癌细胞株RKO中;成功构建了BCL-3　RNAi慢病毒载体,Western blotting实验显示其可抑制RKO细胞中BCL-3蛋白的表达;抑制BCL-3的表达后,增殖实验表明RKO细胞增殖能力下降,软琼脂克隆形成实验表明RKO细胞的克隆形成率下降;MTT实验表明BCL-3表达抑制后奥沙利铂对RKO细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration, IC50）显著降低。结论: BCL-3表达抑制后,BCL-3高表达的大肠癌细胞株RKO的增殖能力下降,并且其对奥沙利铂的敏感性增强。