KAI1基因转染的胰腺癌细胞系的建立

目的转染pCMV—KAI1重组质粒入人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1，观察KAⅡ基因的表达，为进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究提供实验用靶细胞，并为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据。方法采用Western blot方法从7种胰腺癌细胞中筛选出无KAI1表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞株，通过脂质体转染法将pCMV—KAI1重组质粒转染到MiaPacaⅡ和Panc1中，经G418筛选4周，获得单克隆细胞系，应用Western blot、免疫荧光及免疫细胞化学方法检测转染细胞系KAI1蛋白的表达。结果获得了稳定表达KAI1基因的MiaPacaⅡ和Panc1胰腺癌细胞克隆；经Western blot分析显示转染后的胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ与Panc1有明确的分子质量为29100KAI1蛋白表达，而未转染细胞无KAI1蛋白表达；免疫荧光显示，转染的胰腺癌细胞质中可见明显的荧光，而无转染的母细胞无荧光；免疫细胞化学检测显示，无转染的细胞呈阴性反应，转染的细胞呈中到强度的阳性反应。结论pCMV—KAI1重组质粒经转染人人胰腺癌细胞株MiaPacaⅡ和Panc1后可表达KAI1蛋白，从而建立了KAIl蛋白表达的MiaPacaⅡ和Panc1细胞系。     

KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移机制的探讨

目的本研究将pCMV-KAI1重组质粒转染人高转移胰腺癌细胞株PANC Ⅰ和MiaPacaⅡ中,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞侵袭转移能力和运动能力的影响,从基因水平探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的能力.     

KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移机制的探讨

目的　将pCMV KAI1重组质粒转染人高转移胰腺癌细胞株MiaPaCaⅡ中 ,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞侵袭转移能力和运动能力的影响 ,从基因水平探讨KAI1基因抗胰腺癌转移机制。方法　通过脂质体转染法成功将重组质粒转染到MiaPaCaⅡ中 ,利用Transwell小室测定细胞穿膜侵袭运动能力 ,采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测明胶酶活性。结果　pCMV KAI1重组质粒转染后 ,显微镜下细胞计数示转染后胰腺癌细胞穿透基底膜的数量较转染前明显减少 (P <0 0 5 ) ,细胞运动能力明显减弱。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示负染带宽度比转染前变窄 ,亮度减弱 ,降解基质膜和细胞外基质的能力和侵袭转移能力下降。结论　KAI1基因控制胰腺癌细胞转移可能是通过抑制癌细胞侵袭及运动功能来实现的。     

胰腺癌细胞中KAI1蛋白的表达分析

目的研究KAI1基因在人高转移胰腺癌细胞株PANC Ⅰ和MiaPacaⅡ中的表达,并进行KAI1基因在胰腺癌中抗转移作用的有关研究,为今后利用KAI1基因治疗胰腺癌提供实验和理论依据.     

TFPI-2基因体外诱导胰腺癌Panc-1细胞的凋亡

目的: 将TFPI-2基因转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, 研究其对胰腺癌细胞凋亡的影响.方法:将重组质粒pEGFP-C1-TFPI-2通过脂质体介导转染胰腺癌细胞系Panc-1细胞, G418筛选获得阳性细胞克隆后, 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术分别检测转染细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白的表达, 同时测定转染细胞的生长曲线和凋亡情况. 结果: 同转染空载体及未转染细胞相比, 转染成功的Panc-1细胞可以检测到TFPI-2 mRNA和相应蛋白的表达, 细胞生长受到抑制(n = 9, P = 0.02), DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的"梯状"条带.结论:外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长增殖、诱导胰腺癌细胞凋亡.     

KAI1基因抗胰腺癌细胞转移的研究

目的　将pCMV KAI1重组质粒转染入人高转移胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞增殖能力的影响 ,探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的调控作用。方法　通过脂质体转染法将 pCMV KAI1重组质粒成功转染到人胰腺癌细胞株PANCⅠ和MiaPaCaⅡ中 ,采用MTT比色法、细胞集落形成和流式细胞术 (FCM )测定细胞增殖活力和生长周期的变化。结果　pCMV KAI1重组质粒转染PANCⅠ和MiaPaCaⅡ人胰腺癌细胞株后 ,细胞增殖能力较转染前分别降低 4 0 .5 9%和 6 5 .84 % (P <0 .0 5 )。转染KAI1基因的细胞集落形成率 (14 .0 0 % )较转染前 (4 9.5 6 % )明显减少 (P <0 .0 1)。转染后比转染前胰腺癌细胞数量在G0 /G1期明显增加 (PANCⅠ细胞由 4 0 .97%± 1.34%增加到 6 5 .36 %± 1.2 3% ,MiaPaCaⅡ细胞由 2 4 .10 %± 1.0 0 %增加到 4 3.18%± 1.0 6 % ) ,M/G2 期数量降低 (PANCⅠ从 2 1.4 6 %± 0 .96 %降至 13.35 %± 0 .2 2 % ,MiaPaCaⅡ由 2 4 .89%± 1.14 %降至 19.0 6 %± 0 .5 7% ) ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　KAI1基因控制胰腺癌细胞转移可能是通过改变胰腺癌细胞的生长周期 ,抑制癌细胞的增殖及分裂功能来实现的。     

转录因子ETS1 RNA干扰质粒的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,鉴定并建立干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.方法:分别构建3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒(shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3),并将其转染至人胰腺癌PANC-1细胞株,用药物G418筛选出稳定细胞株,Western blot鉴定稳转细胞株中ETS1表达量.结果:3条针对ETS1基因的shRNA干扰质粒转染胰腺癌PANC-1细胞株后,Western blot检测结果显示干扰质粒1(shRNA-1)具有最佳干扰效果.将具有最佳干扰效果的质粒稳定转染人胰腺癌PANC-1细胞株后,经Western blot鉴定相较于对照组稳定细胞株其ETS1表达量明显降低.结论:成功构建了针对人转录因子ETS1的RNA干扰质粒,并建立其稳定转染的人胰腺癌PANC-1细胞株.     

KHI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响

目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97—H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况。结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致。免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度 integra oculus dehter,IOD20.127 ± 5.099 vs 12.675±1.921,P<0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675 ± 1.921,P<0.01).结论:成功构建了KAIl基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.     

携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达

目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA,并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对pkv2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGcsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒:采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列:脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误:绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功:RT-PCR和Western blot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA细胞t'Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质pGCsi-Pyk2 shRNA.并证明他能降4Pyk2在Lovo胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.     

蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌细胞中的表达

目的探讨通过克隆蛋白激酶(SGK)3基因并将其转染乳腺癌MCF-7细胞建立高表达SGK3的MCF-7细胞系的稳态性。方法利用真核表达载体N-端增强型绿色荧光蛋白(p EGFP-N1)通过基因克隆技术构建重组质粒,通过菌落PCR和DNA测序方法对重组质粒进行鉴定。通过PEI介导将重组质粒p EGFP-N1-SGK3转染至乳腺癌MCF-7细胞中,荧光显微镜和Western印迹方法对基因转染效率以及融合蛋白GFP-SGK3的表达进行鉴定。结果成功构建了真核表达质粒,将其命名为p EGFP-N1-SGK3;在荧光显微镜下可见多数细胞发出绿色荧光,表明获得了较高的转染效率;Western印迹结果显示,在转染p EGFP-N1-SGK3的细胞中可见阳性条带,而MCF-7亲本细胞和转染空载体的对照组细胞无阳性条带。结论成功构建了重组质粒p EGFP-N1-SGK3,获得了稳定表达融合蛋白GFP-SGK3的MCF-7细胞系,可用于后续SGK3细胞内功能的研究。