人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的：构建人胰腺癌抑制消减cDNA库。方法：从来源于同一标本的胰腺癌的和癌旁正常组织分离poly(A)^ RNA,经反转录后，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库。结果：挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中457个克隆有插入片段，片段大小范围为250－750pb。结论：应用消减杂交的方法，再经适当的改进，在去除相同遗传背景的条件下，可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减库，该库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因，研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库.方法从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly(A)+ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中 457个克隆有插入片段,片段大小范围为 250～750 pb.结论应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.     

溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库的构建

目的 构建溴氰菊酯抗性白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。 方法 分别提取白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株（R-lab株）和敏感株（S-lab株）总RNA，纯化后获得mRNA，并反转录为双链cDNA。以R-lab株mRNA作为实验方（tester）， S-lab株mRNA作为驱动方（driver），以及R-lab株mRNA为driver方，S-lab株mRNA为tester方，进行正、反双向抑制性消减。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18-T载体， 构建白纹伊蚊对溴氰菊酯抗性和敏感双向消减文库。 结果 分别从正向文库和反向文库中获得580和477个阳性克隆，从所构建文库随机挑选150个克隆进行PCR鉴定，阳性克隆率为93%，cDNA片段主要分布于150～750 bp。 结论 构建了抗溴氰菊酯白纹伊蚊抑制消减cDNA文库。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

日本血吸虫毛蚴侵袭前后湖北钉螺差异表达cDNA文库的构建与分析

目的构建湖北钉螺被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后差异表达cDNA文库,筛选湖北钉螺免疫相关分子,为探讨病原与中间宿主的相互作用奠定基础。方法提取被日本血吸虫毛蚴侵袭前、后湖北钉螺的头足部组织总RNA,纯化mR-NA,反转录合成cDNA。分别以被日本血吸虫毛蚴侵袭前湖北钉螺(未处理组)和被日本血吸虫毛蚴侵袭后湖北钉螺(处理组)的头足部组织作为检测方(Tester)和驱动方(Driver),利用PCR方法选择cDNA杂交试剂盒分别进行正向和反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-T载体,重组质粒转入E.coliDH5α,对菌液用PCR法扩增鉴定其中的插入片段。随机抽取354个阳性克隆进行DNA序列分析,将所得表达序列标签(ESTs)序列在线进行BLAST分析。结果从正向文库随机挑取的354个阳性克隆中测得350个ESTs序列,生物信息学分析发现了34个湖北钉螺新基因,其中1个与已知基因部分同源。结论成功建立了被日本血吸虫侵袭前、后湖北钉螺差异表达片段cDNA消减文库,发现了湖北钉螺新基因,为筛选与湖北钉螺天然免疫相关的分子、进一步探讨中间宿主与病原的相互作用及筛选血吸虫病传播阻断疫苗候选分子奠定了基础。     

人胰岛细胞瘤cDNA文库的构建

采用一种简单高效的互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）克隆技术制备人胰岛细胞瘤的ｃＤＮＡ文库。方法的主要过程如下：以人胰岛细胞瘤的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ为模板，以含ＮｏｔＩ切点的ｏｌｉｇｏ－（ｄＴ）１５为引物，在反转录酶作用下合成第一股单链ｃＤＮＡ；用Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ除去Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ，并以Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ和Ｔ４ＤＮ     

旋毛虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫保护性抗原及特异性诊断抗原基因，我们用异硫氰酸胍从旋毛虫肌肉或幼虫中分离总RNA，用PolyATtractmRNA分离系统统化mRNA，以NotIprimeradapter为引物合成双链cDNA，加SalIadapter,与λgt22A在体外进行连接包装并转染大肠杆菌Y1090r－，构建cDNA文库。结果获得5×105个重组噬菌体，重组率在90％以上．     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有Sfi IB酶切位点的oligo(dT)引物合成第1链cDNA,以含Sfi IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经Sfi I(IA & IB)酶切,以CHROMA SPIN+TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTripIEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库。结果经检测共获得2.73×10~6个重组子,重组率约为94%,插入片段大小平均为1.2 kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的　构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。方法　从人大肠癌组织中提取总RNA ,RT PCR反转录合成cDNA第 1链 ,用长距离PCR技术合成cDNA第 2链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段后与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 ,构建成cDNA噬菌体表达文库。转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,测定重组率。用EXTagTM酶做PCR和SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果　构建成含 2 .39× 10 6pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 %。插入的外源cDNA片段大小为 5 0 0bp～ 4kb ,平均长约 1.4kb。 结论　成功构建高质量人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,适合于免疫筛选cDNA克隆的人大肠癌相关抗原基因。     

Construction of human liver cancer vascular endothelium cDNA expression library and screening of the endothelium-associated antigen genes

AIM: To gain tumor endothelium associated antigen genes from human liver cancer vascular endothelial cells (HLCVECs) cDNA expression library, so as to find some new possible targets for the diagnosis and therapy of liver tumor. METHODS: HLCVECs were isolated and purified from a fresh hepatocellular carcinoma tissue sample, and were cultured and proliferated in vitro. A cDNA expression library was constructed with the mRNA extracted from HLCVECs. Anti-sera were prepared from immunized BALB/c mice through subcutaneous injection with high dose of fixed HLCVECs, and were then tested for their specificity against HLCVECs and angiogenic effects in vitro, such as inhibiting proliferation and inducing apoptosis of tumor endothelial cells, using immunocytochemistry, immunofluorescence, cell cycle analysis and MTT assays, etc. The identified xenogeneic sera from immunized mice were employed to screen the library of HLCVECs by modified serological analyses of recombinant cDNA expression libraries (SEREX). The positive clones were sequenced and analyzed by bio-informatics. RESULTS: The primary cDNA library consisted of 2 x 10(6) recombinants. Thirty-six positive clones were obtained from 6 x 10(5) independent clones by immunoscreening. Bio-informatics analysis of cDNA sequences indicated that 36 positive clones represented 18 different genes. Among them, 3 were new genes previously unreported, 2 of which were hypothetical genes. The other 15 were already known ones. Series analysis of gene expression (SAGE) database showed that ERP70, GRP58, GAPDH, SSB, S100A6, BMP-6, DVS27, HSP70 and NAC alpha in these genes were associated with endothelium and angiogenesis, but their effects on HLCVECs were still unclear. GAPDH, S100A6, BMP-6 and hsp70 were identified by SEREX in other tumor cDNA expression libraries. CONCLUSION: By screening of HLCVECs cDNA expression library using sera from immunized mice with HLCVECs, the functional genes associated with tumor endothelium or angiogenesis were identified. The modified SEREX, xenogeneic functional serum screening, was demonstrated to be effective for isolation and identification of antigen genes of tumor endothelium, and also for other tumor cell antigen genes. These antigen genes obtained in this study could be a valuable resource for basic and clinical studies of tumor angiogenesis, thus facilitating the development of anti- angiogenesis targeting therapy of tumors.