一个有三例女性X-连锁肾上腺-脑白质营养不良杂合子患者家系基因突变分析

目的 对1个有3例女性杂合子患者的X-连锁肾上腺-脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD)家系进行基因突变分析.方法 提取1例患者的外周血白细胞总RNA,以此为模板,采用长链逆转录-PCR技术,分4个片段扩增ABCD1基因(X-ALD疾病基因)编码序列并对其PCR产物进行直接测序.通过PCR和限制性内切酶分析患者及其家庭成员相应的基因组DNA片段,进一步确证所发现的基因突变.对突变及其对ALD蛋白结构的影响进行生物信息学分析.结果 在患者A月CD1基因第1外显子的第283位密码子发现1个新的错义突变:CAC→CGC(p.H283R),此突变使相应DNA片段的1个Msl Ⅰ酶切位点消失,其子不存在此突变.突变所改变的氨基酸残基在进化上高度保守.p.H283R突变位于ALD蛋白的跨膜结构域,可引起该分子跨膜区整体结构的改变.结论 在国内首次报道了3例杂合子女性X-ALD患者,并在其家系发现了1个新的ABCD1基因突变,即p.H283R突变.     

一例α1,4半乳糖基转移酶基因一碱基缺失导致p表型

目的　研究 α1,4半乳糖基转移酶基因决定 p表型的分子基础。　方法　在标准血清学鉴定红细胞表型的基础上 ,PCR扩增 p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因的第 3外显子编码区序列 ,PCR产物经割胶纯化后直接进行测序分析。结果　p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或30 1位核苷酸 G缺失 (TCGG→ TCG) ,导致阅读框架在第 10 1位氨基酸发生移码 ,在第 113位氨基酸处提前形成终止密码。先证者父母为杂合缺失携带者。　结论　发现了 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或 30 1位处 G缺失突变 ,该突变可能是 p表型的分子机理之一。     

α1,3半乳糖基转移酶基因721C>T突变导致B_w亚型

目的　研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础。方法　通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw 亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序。同时将第6和7外显子克隆到pc DNA3.1(- )质粒,转化DH5α后进行序列分析。采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变。结果　直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/ O杂合,其中糖基转移酶基因的第2 6 1位G杂合缺失,第72 1位C/ T杂合。克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第72 1位C>T突变,导致多肽链Arg2 4 1Trp替换。序列特异性引物-聚合酶链反应检测14 0份随机样本未发现此突变。结论　α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子72 1C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一。     

一个表皮松解性掌跖角化病家系的角蛋白9基因突变研究

目的 确定一个中国汉族表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma,EPPK)家系角蛋白9基因(keration 9,KRT9)的突变情况,并分析基因型与表型的对应关系.方法 收集该家系12例患者、13名健康者和100名无亲缘关系的正常人的外周血,提取基因组DNA.采用PCR扩增KRT9基因的第1和第6外显子,对PCR产物进行双向测序以检测基因突变.结果 在所有患者中均检测到KRT9基因第1外显子中的杂合型488G→A突变,导致第163位的精氨酸被谷氨酰胺取代(R163Q).在家系中13名正常人和家系外100名正常人未检测到同样的突变.结论 KRT9基因的错义突变488G→A是该家系发生表皮松解性掌跖角化症的主要原因.     

肾上腺脑白质营养不良外显子6、7、8基因突变研究

目的 探讨中国人X-连锁隐性遗传肾上腺脑白质营养不良(adrenoleulkodystrophy)的分子发病机理。方法 应用聚合醇链反应(polymerase chain reaction)结合DNA测序技术(DNA sequencing)，对收集的6例患者、患者母亲及20名正常对照的ALD基因外显子6、7、8及其侧翼进行突变检测。结果 检出一例患者在ALD基因外显子6发生了Val517Ile(G→A)的碱基错义突变；另一侧患者在ALD基因外显子7发生了Gln556Arg(A→G)的碱基错义突变。ALD基因突变合成异常不稳定的蛋白(ALDP)，从而使VLCFA在脑白质、肾上腺及血浆聚集增多，导致疾病发生。结论 ALD基因突变是中国人X-连锁隐性遗传ALD发病原因之一。     

一个中国人裂手足伴并指趾畸形家系的表型和基因型分析

目的 确定一个中国人裂手足家系的致病性基因突变,探讨基因型-表型关系.方法 收集患者及其家庭成员的外周血,提取基因组DNA.采用PCR扩增P63基因和HOXD13基因的外显子,对PCR产物进行双向测序检测基因突变.结果 在所有患者中检测到P63基因第7外显子的杂合型956G→A突变,导致蛋白产物第280位的精氨酸被组氨酸取代(R280H).在正常家庭成员中未检测到该突变.结论 该家族中的患者以对称性裂手足伴并指趾为主要特征,由P63基因的R280H突变所致.     

江苏徐州地区肝豆状核变性患者ATP7B基因8、13号外显子突变的检测和分析

目的研究徐州地区肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD)患者ATP7B基因8、13外显子突变情况,为本病的早期和产前诊断提供理论依据。方法采集33例HLD患者和30例对照组正常人外周血、提取DNA、PCR扩增ATP7B基因8和13外显子;对扩增产物分别进行限制性内切酶MspI及BtgI酶切分析,反应异常者行DNA测序,最后将突变结果与临床表型作相关性分析。结果 33例HLD患者中,15例存在MspI酶切异常,测序为Arg778Leu杂合或纯合突变,占45.45%(15/33);9例存在BtgI酶切异常,测序为Pro992Leu杂合突变,占27.27%(9/33)。30例正常对照组未检测出突变。结论 ATP7B基因第8、13外显子是徐州地区HLD患者的基因突变热区,筛选本地区HLD可疑患者时应优先检测。     

非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体基因第19外显子突变研究

目的 研究非小细胞肺癌的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因第19外显子突变情况.方法 提取72例手术切除肺癌基冈组DNA,用巢式PCR扩增EGFR基因第19外显子并测序,分析EGFR基因第19外显子突变及其与I临床特征的相关性.结果 检测到13例肿瘤组织存在EGFR基因第19外显子多核苷酸的缺失突变,共有4种突变类型,突变率为18.1%,所检测的突变均为杂合型;EGFR基因第19外显子突变与肺腺癌、女性患者与不吸烟者相关.结论 EGFR基因第19外显子存在多核苷酸的框架缺失突变,以女性、腺癌和不吸烟患者为主.     

Crouzon综合征基因突变检测

目的 研究1个Crouzon综合征家系及1例散发的Crouzon综合征患者的成纤维生长因子受体2(fibroblast growth factors receptor 2,FGFR2)基因突变情况.方法 在1个Crouzon综合征家系的10名成员,和另一例散发者的外周血提取基因组DNA,PCR扩增FGFR2基因的第8和10外显子(部分家族成员仅扩增第8外显子),产物纯化后直接进行DNA测序检测突变.结果 家系中3名成员及另1例散发者FGFR2基因第8外显子的833位核苷酸发生G→T的转换突变,该突变为错义突变,使该位点所编码的氨基酸由半胱氨酸变为苯丙氨酸(C278F).该突变为杂合子突变.结论 FGFR2基因突变是Crouzon综合征致病原因.     

应用高分辨熔解曲线技术检测中国人Wilson病的常见基因突变

目的 应用PCR-高分辨熔解曲线分析技术检测中国人Wilson病(Wilson disease,WD)患者中ATP7B基因内高频突变区第8和13外显子.方法 酚-氯仿法提取外周全血基因组DNA;PCR扩增患者ATP7B基因第8和13外显子及两个外显子中的突变热点区域,PCR产物经HR-1进行高分辨熔解曲线分析;进一步以限制性内切酶或(和)DNA测序法对高分辨熔解曲线检测结果进行验证.结果 在30例WD患者中,检测到R778L纯合子3例,R778L杂合子6例,P992L杂合子6例,P992D/S975Y的复合杂合子1例,R778L/P992L复合杂合子2例和R778L/752.33delG复合杂合子1例.本组样本中,R778L、P992L和S975Y的基因频率分别为25%、15%和1.67%.测序及限制性内切酶分析结果完全与高分辨熔解曲线分析结果一致.结论 高分辨熔解曲线分析检测ATP7B基因突变具有简便、快速、特异和灵敏等优点,可作为Wilson病患者及携带者突变筛查的优选方法.     

3个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的　对 3个肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,AL D) ( MIM# 30 0 10 0 )家系进行基因突变分析。方法　从 3个 AL D患儿及其主要家系成员的外周血白细胞 ,提取总 RNA和基因组 DNA。应用逆转录聚合酶链反应技术 ,对 3个家系的 ABCD1基因编码区 ,分 4个片段进行 PCR扩增并对 PCR产物直接测序。同时应用 PCR-限制性酶切或扩增阻滞突变系统分析相应的基因组 DNA,进一步确证ABCD1基因的突变位点。结果　 3名患儿的 ABCD1基因上均存在错义突变 ,其中患儿 1的 ABCD1基因第 5 34位密码子发生 CCC→ CGC改变 ,使脯氨酸被精氨酸取代 ( P5 34R) ;患儿 2的 ABCD1基因第 2 6 6位密码子发生 GGG→AGG改变 ,使甘氨酸被精氨酸取代 ( G2 6 6 R) ;患儿 3母亲的 ABCD1上一个等位基因第 6 17位密码子发生 CGC→ GGC改变 ,使精氨酸被甘氨酸取代 ( R6 17G) ,另一个等位基因未发生突变。结论　在中国人 AL D患者中发现 1个新的 ABCD1基因突变 ( P5 34R) ,并首次在中国人 AL D患者中检测到G2 6 6 R、R6 17G突变     

X-连锁的肾上腺脑白质营养不良患者ABCD1基因突变分析

目的　分析我国 X-连锁的肾上腺脑白质营养不良 (X- linked adrenoleukodystrophy,X- AL D)患者 ABCD1基因突变。方法　提取 2 5例 AL D患者外周血基因组 DNA,用 PCR扩增和 DNA直接测序的方法 ,分析 AL D患者 ABCD1基因突变。结果　 2 5例患者中发现 18例有 17种不同的 ABCD1基因突变 ,突变存在于除 4、9和 10以外的每一个外显子 ,错义突变为最常见的类型。10例患者有 10种不同的错义突变 ,其中4种错义突变是国际首次报道 ;3例患者有 3种不同的无义突变 ;1例患者有碱基缺失导致移码突变 ;1例患者有剪切部位的碱基缺失 ;2例患者同时具有两个相同的同义突变。结论　我国 AL D患者大部分存在ABCD1基因突变 ,无突变热点。不同个体常有不同的突变点 ,检测到的突变率约为 70 %。突变类型和表型之间无特殊的相关关系。     

应用双侧扩增阻滞突变系统排除肾上腺脑白质营养不良分子诊断中假基因的干扰

目的应用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）排除ABCD1假基因的干扰，对肾上腺脑白质营养不良（adrenoleukodystrophy，ALD）家系进行基因突变分析。方法按ARMS引物设计原则设计上游引物（正常引物、突变引物）和下游公共引物，对家系成员的基因组DNA分别进行PCR扩增。结果R617C突变患者及其母亲的突变引物均扩增出特异性条带（107bp），患者父亲和对照则未见条带，在基因组DNA水平证实了R617C突变的存在。结论双侧ARMS方法可以快速、有效地排除假基因干扰。     

肾上腺脑白质营养不良外显子1,5基因突变分析

目的　探讨中国人性染色体隐性遗传肾上腺脑白质营养不良 (adrenoleukodystrophy,AL D)的分子发病机理。方法　应用聚合酶链反应结合 DNA测序技术 ,对 4例患者、患者母亲及 2 0名正常对照者的 AL D基因外显子 1、外显子 5及其侧翼进行突变检测。结果　发现 1例患者在 AL D基因外显子 5内含子 5交界处发生了 1875 G→ A突变 ,这种突变可能导致外显子 5和外显子 6剪接异常 ,合成异常蛋白 ,从而使极长链脂肪酸在脑白质、肾上腺及血浆聚集增多 ,导致疾病发生。结论　 AL D基因内含子 5的 5′剪切点突变 ,导致外显子 5和外显子 6剪接异常为性染色体隐性遗传肾上腺脑白质营养不良发病原因之一     

肾上腺脑白质营养不良的产前分子诊断

目的对2名来自不同家系的肾上腺脑白质营养不良携带者所怀胎儿进行产前分子诊断。方法在采用STR位点分析方法排除母体基因组DNA污染后，应用扩增阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法对胎儿1羊水基因组DNA进行检测，应用PCR-RFLP和DNA序列测定对胎儿2羊水基因组DNA进行分析。结果在针对R617G突变的扩增阻滞突变系统中，当使用突变引物时，从胎儿1羊水DNA、胎儿1母亲基因组DNA均扩增出185bp的预期特异性条带，而胎儿1父亲和对照则未扩出。在斑点杂交反应中，应用R617G突变型探针时，只有胎儿1羊水细胞及其母亲外周血基因组DNA出现特异性显色斑点。在第2个家系中，先用PCR扩增出横跨P534R突变位点的基因组DNA片段（506bp），应用HoeⅡ酶切此产物，胎儿2以及其父亲、无关对照均未见切割，其母亲的部分产物被切割成396bp和110bp两个片段。对此PCR产物进行DNA序列测定，未在胎儿2中检测出P534R突变。结论胎儿1带R617G突变，为肾上腺脑白质营养不良半合子；胎儿2不带P534R突变，为正常半合子。     

中国人WD基因第14和18号外显子的错义突变

目的了解中国人肝豆状核变性（Ｗｉｌｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ,ＷＤ）基因第１４和１８号外显子的突变情况,与国外报道的这两个外显子的高突变频率进行比较。方法应用聚合酶链反应－单链构像多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）结合ＤＮＡ测序技术,对４４例无亲缘关系的ＷＤ患者及６０例正常对照进行突变检测。结果一例患者在１４号外显子发生了Ａｒｇ１０４１Ｐｒｏ（３１２１Ｇ→Ｃ）纯合错义突变,另一例患者在１８号外显子发生了Ａｓｎ１２７０Ｓｅｒ（３８０９Ａ→Ｇ）杂合错义突变。结论Ａｒｇ１０４１Ｐｒｏ为未报道过的新型错义突变,Ａｓｎ１２７０Ｓｅｒ突变与国外报道一致。但均未呈热区分布。     

Decreased expression of ABCD4 and BG1 genes early in the pathogenesis of X-linked adrenoleukodystrophy

Childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCER), adrenomyeloneuropathy (AMN) and AMN with cerebral demyelination (AMN-C) are the main phenotypic variants of X-linked adrenoleukodystrophy (ALD). It is caused by mutations in the ABCD1 gene encoding a half-size peroxisomal transporter that has to dimerize to become functional. The biochemical hallmark of ALD is the accumulation of very-long-chain fatty acids (VLCFA) in plasma and tissues. However, there is no correlation between the ALD phenotype and the ABCD1 gene mutations or the accumulation of VLCFA in plasma and fibroblast from ALD patients. The absence of genotype-phenotype correlation suggests the existence of modifier genes. To elucidate the mechanisms underlying the phenotypic variability of ALD, we studied the expression of ABCD1, three other peroxisomal transporter genes of the same family (ABCD2, ABCD3 and ABCD4) and two VLCFA synthetase genes (VLCS and BG1) involved in VLCFA metabolism, as well as the VLCFA concentrations in the normal white matter (WM) from ALD patients with CCER, AMN-C and AMN phenotypes. This study shows that: (1) ABCD1 gene mutations leading to truncated ALD protein are unlikely to cause variation in the ALD phenotype; (2) accumulation of saturated VLCFA in normal-appearing WM correlates with ALD phenotype and (3) expression of the ABCD4 and BG1, but not of the ABCD2, ABCD3 and VLCS genes, tends to be correlated with the severity of the disease, acting early in the pathogenesis of ALD.     

X-linked adrenoleukodystrophy: diagnostic and follow-up system in Japan

X-linked adrenoleukodystrophy (ALD) is an intractable neurodegenerative disease associated with the accumulation of very long-chain saturated fatty acids (VLCFA) in tissues and body fluids. We have established a Japanese referral center for the diagnosis of ALD, using VLCFA measurements and mutation analysis of the ABCD1 gene, and have identified 60 kinds of mutations in 69 Japanese ALD families, which included 38 missense mutations, 6 nonsense mutations, 8 frame-shift mutations, 3 amino acid deletions, 2 exon-skip mutations and 3 large deletions. A total of 24 kinds of mutations (40%) were identified only in Japanese patients by referring to the current worldwide ALD mutation database. There was no clear correlation between these mutations and phenotypes of 81 male patients in these 69 families. About 12% of the individuals with ALD had de novo mutations by mutation analysis in the male probands and their mothers, which should be helpful data for genetic counseling. The only effective therapy for the cerebral form of ALD should be hematopoietic stem cell transplantation at the early stages of the cerebral symptoms, therefore, we performed presymptomatic diagnosis of ALD by extended familial screening of the probands with careful genetic counseling, and established a long follow-up system for these patients to prevent the progression of brain involvement and to monitor the adrenocortical insufficiency. Further elucidation of pathology in ALD, especially concerning the mechanisms of the onset of brain involvement, is expected.     

4个肾上腺脑白质营养不良家系的基因诊断

目的对4个肾上腺脑白质营养不良家系进行基因突变分析。方法应用RT-PCR技术,对4个患者的AB-CD1基因编码区,分4个片段进行扩增并对PCR产物直接测序。应用变性高效液相色谱技术、PCR-限制性酶切等方法分析相应的基因组DNA,进一步确证ABCD1的突变位点。结果在3名肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因上,存在2个不同的碱基置换(807G>A和2113T>C)和1个碱基插入(1126insGCCATCG),分别造成2个错义突变(A141T和L576P)和1个移码突变(fsI246);在患儿1母亲的一个ABCD1等位基因上存在1801-1802位碱基缺失,造成移码突变(fsE471),另一个等位基因未发现突变。结论在中国人ALD患者中发现2个新的ABCD1基因突变(fsI246、L576P)。不同家系具有不同的突变位点,且突变类型和表型之间无特殊的相关性。