脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

脐带血清促进牙髓干细胞增殖作用的研究

目的　建立脐带血清（ umbilical cord blood serum，CBS）培养体系，替代胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）体外扩增牙髓干细胞（dental plup stem cells,DPSC）。方法　取各项病原微生物测定皆显示阴性的人CBS用作细胞培养。提取人完整且无龋坏的正畸拔除牙或第三磨牙的牙髓干细胞，设置四个实验组，其中对照组为含10%胎牛血清培养基培养的牙髓干细胞，其他三组分别为含5%、10%、20%脐带血清培养基培养的牙髓干细胞。经由MTT法对比4个组细胞增殖速度；对增殖速度最快的一组，通过不同诱导液对其DPSCs施以诱导，使其分别分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞，对其多向分化活性加以证实；FCM（流式细胞术）对细胞表面标记物表达展开测定。结果1、脐带血清可培养出能够稳定传代的牙髓干细胞系；2、MTT结果显示，各组牙髓干细胞在1，3，5，7，9天内均呈现不同程度的生长状态，且呈线性增长，呈“S”型。其中10%脐带血清组在第7天后细胞增殖较为明显；3、培养出的牙髓干细胞具有多向分化能力；4、FCM测定培养出的第3代DPSC表面标记物表达水平，MSCA-1、CD73与CD90为阳性表达，CD34与CD45为阴性表达，与间充质干细胞表面标记物表达特性相符。结论　脐带血清培养体系于体外条件下对DPSC增殖具促进作用，且培养所得DPSC具备干细胞特性。     

密度梯度法与羟乙基淀粉法培养脐血间充质干细胞比较

目的 比较密度梯度离心法与羟乙基淀粉法体外分离培养脐血间充质细胞（hUCB-MSCs）的成功率,为今后细胞移植和基因治疗提供重要的细胞来源.方法 取44份足月儿顺产或剖宫产脐带血,分为两组,每组22份,分别用密度梯度离心法结合贴壁法与羟乙基淀粉法分离脐血中单个核细胞,专用培养基培养,观察两种方法培养所得细胞的形态变化并绘制生长曲线,用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达.结果 羟乙基淀粉法培养hUCB-MSCs的成功率（36.36％）高于密度梯度离心法结合贴壁法的培养成功率（9.1％）（P＜0.05）.两种方法所得细胞在形态、生长曲线和表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达无明显差异（P＞0.05）.结论 羟乙基淀粉法可以提高hUCB-MSCs培养成功率,为hUCB-MSCs在临床中应用奠定基础.     

人脐带间充质干细胞培养上清液对甲状腺乳头状癌细胞诱导人脐静脉内皮细胞血管形成的影响

目的: 探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）血管形成的作用。方法: 使用不同浓度的hUCMSCs培养上清液（hUCMSC-CM）刺激甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1;采用基质胶小管形成实验检测经hUCMSC-CM作用后的TPC-1细胞对HUVEC血管形成的影响;CCK-8法检测hUCMSC-CM对TPC-1细胞增殖能力的影响;实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附实验（ELISA）分别检测经hUCMSC-CM作用后的TPC-1细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的mRNA和蛋白表达及其培养上清液中VEGF的含量。结果： 与对照组相比,hUCMSC-CM可显著抑制TPC-1细胞的增殖（P<0.05和P<0.01）;经hUCMSC-CM刺激后的TPC-1细胞诱导HUVEC血管形成能力显著下调（P<0.001）,且TPC-1细胞中VEGF的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.001）,其培养上清液中VEGF含量显著降低（P<0.05）。结论： hUCMSC-CM可显著下调TPC-1细胞中VEGF的表达及分泌,抑制TPC-1细胞诱导HUVEC血管形成的能力。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人脐带间充质干细胞源胞外囊泡促进施万细胞增殖和迁移

目的: 探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）源胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）对施万细胞增殖和迁移的影响。方法: 应用高速离心法从hUCMSCs上清液中分离和纯化EVs（hUCMSC-EVs）,透射电镜观察EVs形态特征;蛋白质印迹法检测EVs标志性蛋白CD63和CD9的表达;通过CCK-8和Transwell小室实验检测不同浓度的hUCMSC-EVs对施万细胞增殖和迁移能力的影响;共聚焦显微镜观察原代施万细胞对EVs的内吞。结果： hUCMSC-EVs呈圆形或椭圆形,且表达特异性分子标志物CD9和CD63;与对照组相比,hUCMSC-EVs显著促进施万细胞增殖和迁移（P均<0.05）;hUCMSC EVs与施万细胞孵育后细胞膜融合。结论： hUCMSC-EVs可显著促进施万细胞的增殖和迁移且呈浓度依赖。     

月经血间充质干细胞和人脐带间充质干细胞的生物学特性比较

目的 比较月经血间充质干细胞(menstrual blood mesenchymal stem cells, MenSCs)和人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)的生物学特性。方法 从月经血和脐带中分离间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),通过流式细胞术、免疫细胞化学、CCK8法比较两种干细胞表面标记物、细胞增殖情况;实验分组分为对照组、MenSCs-CM组、hUCMSCs-CM组,采用CCK8法、划痕、血管形成实验检测两种干细胞对人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的增殖、迁移以及血管形成能力的影响。结果 两种干细胞都贴壁生长,呈梭形;均高表达CD90、CD44、CD73、CD105,低表达CD14、CD45、CD34,不表达HLA-DR;MenSCs和hUCMSCs均表达SOX2及VEGFA,但MenSCs还高表达OCT4;MenSCs-CM组和hUCMSCs-CM组对HUVECs...     

人脐血单个核细胞中Nestin阳性细胞表达及其临床意义

目的观察脐血单个核细胞是否表达nestin抗原及表达量的多少;探讨人脐血单个核细胞(human cord blood mononuclear cells,HCMNCs)对神经系统疾病治疗的潜能.方法采集正常分娩胎儿的脐血.以淋巴细胞密度梯度离心法分离人脐血细胞(human cord blood cells,HUCBCs).用免疫组化法测定HCMNCs及外周血细胞(human peripheral blood cells,HPBCs)中nestin阳性细胞;流式细胞仪(flow cytometer,FCM)分析HCMNCs中nestin阳性细胞的比例及细胞周期.结果脐血中有nestin阳性细胞,约占HCMNCs的(4.32±0.66)%.HCMNCs的G1/0期细胞显著少于外周血而S期细胞则显著多于外周血,G2/M期细胞无显著差异.结论人脐血单个核细胞确能表达nostin抗原.这将为HCMNCs在神经系统应用提供一定的理论依据.     

人脐带血间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的研究脐带血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要;探讨经尾静脉移植脐血间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法无菌条件下采集健康育龄产妇正常分娩胎儿的脐带血42份,脐血随机分成3组:FBS(胎牛血清)未包被组、FBS包被组和mesencult培养基组。FBS未包被组和FBS包被组均使用含10%FBS的LG-DMEM培养基、mesencult培养基组使用专用来培养干细胞的mesencult培养基,与其添加物配合使用。3组均用Ficoll淋巴细胞分离液,密度梯度法分离脐血单个核细胞(MNC),将单个核细胞按密度1×108/ml接种于T25培养瓶中,置37℃饱和湿度含5%CO2孵育箱培养,72 h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后均7 d换液1次。待细胞长到80%铺满瓶底时结束原代培养。按1∶1进行消化传代。观察不同培养条件对脐血MSCs生长的影响。取P2代细胞用流式细胞仪检测细胞表面CD 29、CD 34、CD45、CD 105标志。将36只SD大鼠随机分成MSCs移植组、假手术组和心肌梗死植组各12只,结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型。心肌梗死后1周,经尾静脉注射脐血MSCs,4周后测定大鼠血流动力学。结果 42份脐血中单个核细胞原代培养,其中仅8份传代培养成功,而其中mesencult条件培养基有5份培养成功,明显高于FBS包被组(3份)和FBS未包被组(0份)。流式细胞仪检测第2代的脐血MSCs结果显示,P2代MSCs不表达或极弱表达CD 34,CD45造血细胞标志,稳定地高表达CD 29、CD 105间充质细胞相关的表面抗原标记。这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。移植后4周,经血流动力学检测,与心梗组比较,MSCs移植组左室心功能明显改善(P0.05)。结论将脐血单个核细胞以高密度(1×108cells/ml)接种在mesencult培养基中可以在体外成功培养出较纯化的脐血MSCs,其培养成功率较高。脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征。脐血MSCs移植能促进心梗大鼠心功能恢复。     

舒芬太尼对人脐血树突状细胞免疫功能的影响

目的探讨舒芬太尼对人脐血树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法无菌条件下采集脐带血70 ml,经密度梯度离心法获得脐血单个核细胞,然后分3组进行培养。阴性对照组(N组):只加rhGM-CSF 50 ng/ml和rhIL-4 10 ng/ml培养10 d;阳性对照组(P组):在加入rhGM-CSF、rhIL-4培养的同时加入rhTNF-α50 ng/ml培养10 d诱导成熟树突状细胞;药物组(S组):加入rhGM-CSF、rhIL-4的同时加入舒芬太尼其浓度分别为(0.2、0.5、1.0)ng/ml(S_(0.2)、S_(0.5)、S_(1.0)培养10 d。培养过程中在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态学变化;以流式细胞仪分析各组细胞免疫表型CD80、CD86、CD83、HLA-DR分子的表达;ELISA法测定其分泌IL-12的水平;MTT法检测DCs刺激混合淋巴细胞的增殖能力。结果与N组比较,S组和P组细胞具有典型的树突状细胞形态学特征,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子的表达增加(P<0.05),促进同种异体混合淋巴细胞增殖的能力较强(P<0.05),IL-12表达增加(P<0.05);与P组比较,S组细胞随舒芬太尼药物浓度增加树突状伪足逐渐不明显,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子表达以及促进混合淋巴细胞增殖能力呈不典型的剂量依赖性下降趋势(P<0.05),IL-12表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论脐血来源的单个核细胞可在舒芬太尼的刺激下诱导为成熟的树突状细胞,但舒芬太尼对树突状细胞成熟和免疫功能的影响具有剂量依赖性下降趋势。     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

人脐血单个核细胞的体外培养观察

目的对脐血间充质干细胞进行体外培养，以进一步阐明其生物学特性，为今后的基础研究和临床应用打好基础。方法采用DMEM培养基培养脐血单个核细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志。结果脐血单个核细胞在体外培养24d时，细胞表面CD11b、CD34、CD44和CD45表达阴性，GFAP和nestin表达也为阴性。结论培养所得的单个核细胞区别于脐血中的造血干细胞。     

新生儿脐带血T细胞亚群的流式细胞仪检测

目的：检测我国新生儿脐带血T细胞亚群的变化.方法：使用全自动血液分析仪进行血常规检测;荧光素标记的抗CD4/抗CD8/抗CD3和抗CD4/抗CD25/抗CD3单克隆抗体对血液细胞表面分子进行免疫荧光染色,用流式细胞术进行各细胞亚群计数和分析.结果：新生儿脐带血中红细胞（RBC）计数、血红蛋白（Hb）含量、白细胞（WBC）计数、淋巴细胞百分比与成人外周血有显著性差异.新生儿脐带血组中CD3^＋T细胞、CD3＇CD4^＋T细胞、CD3^＋CD8^＋T细胞、CD4^＋CD8^＋T细胞、CD4^＋CD25^high调节性T细胞、CD4^＋CD25^intT细胞、CD4^＋CD25^-T细胞绝对计数及其在各自细胞亚群中的百分比均存在显著性差异.结论：中国正常新生儿脐带血与成人外周血的RBC、Hb、WBC及T细胞亚群检测结果存在显著性差异,这与新生儿免疫机制发育不完全是相符合的.     

混合脐血浆在人脐静脉内皮细胞培养中的应用

目的：观察混合脐血浆在人脐静脉内皮细胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ,ＨＵＶＥＣ）培养中的作用。方法：在含２０％（体积分数）混合脐血浆的内皮细胞培养体系中进行ＨＵＶＥＣ的原代和传代培养,并对培养细胞进行纯度鉴定。同时用噻唑蓝试验观察不同体积分数的混合脐血浆对ＨＵＶＥＣ增殖活力的影响。结果：２０％（体积分数）的混合脐血浆对ＨＵＶＥＣ培养有明显支持作用,该体系培养的ＨＵＶＥＣ经第Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ：Ａｇ）和Ⅰ型荆豆凝集素（ＵＥＡⅠ）鉴定纯度可达９３．１％。结论：２０份混合的脐血浆可以代替内皮细胞生长因子成功地用于ＨＵＶＥＣ的培养,以获得高纯度可传代的内皮细胞。     

脐血来源富血小板血浆对脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:初步探讨脐血来源富血小板血浆促进脐血间充质干细胞增殖及增殖最佳浓度。方法:收集足月健康剖宫产新生儿脐带血,采用组织块培养法进行脐血间充质干细胞的分离培养;采用二次离心法提取脐血富血小板血浆。用ELISA方法检测富血小板血浆中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1。富血小板血浆联合10%胎牛血清培养脐血间充质干细胞,根据富血小板血浆中的TGF-β1浓度将实验分为6组:2 000 pg/ml组、1 000pg/ml组、750 pg/ml组、500 pg/ml组、250 pg/ml组、10%胎牛血清组。脐血间充质干细胞接种在96孔板,连续培养7d,分别在1、3、5、7 d用CCK8试剂盒测定不同浓度富血小板血浆对脐血间充质干细胞的增殖影响,统计分析,选出最佳浓度。结果:不同浓度富血小板血浆联合10%胎牛血清培养脐血间充质干细胞呈现不同的增殖速度,500~1 000pg/ml组明显优于其他浓度组,第5天开始差异有统计学意义(P<0.05)。结论:富血小板血浆可提高脐血间充质干细胞的增殖活性,且呈剂量依赖性。     

低温对人脐血内皮祖细胞的影响

目的将人脐血中分离培养出的内皮祖细胞进行低温保存和快速复苏,建立EPC细胞系,比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变。方法采集人脐血,分离出单核细胞,对细胞进行冻存和复苏,测定内皮祖细胞增殖能力及黏附能力。结果内皮祖细胞经冻存和复苏后测得细胞的存活率为（84.17±4.02）%,细胞的形态学未见明显改变;与未冻存的细胞相比,刚复苏后即行增殖和黏附能力的检测,细胞的增殖和黏附能力有显著变化,P〈0.05;细胞复苏后继续培养48h行增殖和黏附能力检测,两者未见明显差异,P〉0.05。结论对低温保存后复苏的EPC,立即行增殖和黏附能力检测其能力均降低,复苏后继续培养48h再次检测未见明显差异。     

Conversion of mononuclear cells from human umbilical cord blood into hepatocyte-like cells

Objective: To evaluate the differentiation of human umbilical cord blood cells into hepatocyte-like cells. Methods: Mononuclear cells (MNCs) derived from human umbilical cord blood were isolated using Ficoll. The experiment was derived into 3 categories:(1) MNCs co-cultured with 50 mg minced liver tissue separated by a trans-well membrane and then collected at 0 h,24 h,48 h and 72 h; (2) MNCs cultured along supplemented with 100 ml/L FBS. 100μ/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin. 4. 7μg/ml linoleic acid, 1×ITS, 10-4 mol/L L-Ascorbic acid 2-P and a combination of FGF4 (100 ng/ml) and HGF (20 ng/mL). Cells were then collected at 0 d and 16 d to examine the expression profile of hepatocyte correlating markers;(3) 0. 2-0. 3 ml of MNCs with a cell density of 2×107/ml were transplanted into prepared recipient mice [n = 12, injected with 0. 4 ml/kg (20%) CCl4 and 150 ng/kg 5-fluorouracil (5-Fu) prior the transplant 24 h and 48 h, respectively] via injection through tail vein. Mice were sacrificed 4 weeks after transplantation. The hepatocyte correlating mRNAs and proteins were determined by RT-PCR, immunohistochemical analysis and immunoflurence technique. Results: (1) After 72 h. a number of glycogen positive stained cells were observed with MNCs co-cultured with damaged mouse liver tissues. The expression of hepatocyte markers, human albumin (ALB),α-fetal protein (AFP) and human GATA4 mRNA and proteins were detected by RT-PCR and immunohistochemistry as well. For the confirmation, the DNA sequencing of PCR products was performed. In control groups, MNCs co-cultured with normal mouse hepatocytes or MNCs cultured alone, all markers remained negative. (2) In growth factor supplemented culture system, MNCs developed into larger volume with richer cytoplasm and binucleation after 16 d. Positive expression of ALB, AFP, CK18 and CK19 mRNA were detected with RT-PCR, and ALB positive staining was observed by immunocytochemistry as well. In contrast. MNCs cultured without exogenous growth factors scarcely attached to the culture dish and ALB mRNA was not detected. (3) In transplantation experiment, both of ALB and AFP mRNA were detected by RT-PCR and HSA, PCNA and ALB positive staining were observed in the livers of recipient mice by immunocytochemistry. Conclusion: MNCs from human umbilical cord blood could convert into hepatocyte-like cells in 3 different ways, indicating their potential use in the clinic applications for the treatment of human liver diseases.